Rizikové faktory pro rozvoj incizní kýly u příčných řezů

CÍLE VÝZKUMNÉHO PROJEKTU Cílem předkládaného vědeckého projektu je stanovit faktory, se zvláštním zřetelem na typ chirurgické techniky, akumulaci konečných produktů pokročilé glykace ve tkáni a obsah kolagenu v transversalis fascii, spojené s rozvojem incizní kýly po transverzální incizi v epigastrické oblasti u pacientů operovaných pro zhoubné nádory PRACOVNÍ PLÁN Tato studie je plánována jako prospektivní hodnocení faktorů spojených se vznikem incizních kýl po příčných řezech v epigastrické oblasti u pacientů podstupujících chirurgickou léčbu maligních nádorů trávicího systému. Hlavní hypotézou této studie, která tvoří základ pro výpočty velikosti vzorku, je přítomnost spojení mezi aplikací hromadného kontinuálního uzávěru břicha a snížením rizika incizní kýly z 35 % na 20 % ve srovnání s vrstveným kontinuálním stehem . Při použití prahové hodnoty pro hladinu chyby typu I 0,05 a prahové hodnoty pro pravděpodobnost chyby typu II na úrovni 20 % je celkový počet pacientů, kteří by měli být zařazeni do studie, 284 (142 pacientů v obou 2 ramena). Nicméně, vezmeme-li v úvahu přibližnou hodnotu dvouletého přežití pacientů ve výši 20 % a další 10% míru ztrát do sledování, je plánováno, že studie zahrne kumulativní počet 392 pacientů (196 v obou větvích).

Primárním cílovým bodem této studie je rozvoj prasknutí břicha v bezprostředním pooperačním období (do propuštění z nemocnice) nebo incizní kýla během 2letého období sledování (kombinovaný cíl). Sledovací protokol používaný pro hodnocení incizních kýl při propuštění z nemocnice a dvě kontrolní návštěvy 1 a 2 roky po operaci. Hodnocení přítomnosti incizní kýly bude v každém případě založeno na klinickém i ultrasonografickém vyšetření.

Primárním faktorem, který bude posuzován z hlediska možné souvislosti s rozvojem incizních kýl, je operační technika použitá pro uzávěr břicha. Technika zahrnující kontinuální suturu a masový uzávěr (jedna vrstva stehů zahrnující peritoneum, transversalis fascii, zadní a přední vrstvu fascie přímého břišního svalu a případně fascie šikmých břišních svalů) bude porovnána s technikou 2 samostatné vrstvy kontinuálních stehů zahrnující peritoneum, transversalis fascii a zadní vrstvu fascie přímého břišního svalu (první vrstva) a přední vrstvu fascie přímého břišního svalu a potenciálně s fascií šikmých břišních svalů (druhá vrstva). Pacienti budou náhodně rozděleni do jednoho ze dvou ramen v poměru 1:1 na základě nakreslení zalepené obálky s kódem specifickým pro typ intervence. Ani pacienti zařazení do studie, ani zkoušející hodnotící přítomnost incizní kýly během následných návštěv si nebudou vědomi typu chirurgické techniky použité pro uzavření břicha (dvojitě zaslepená studie).

Pouze odborníci přítomní na operačním sále během chirurgického zákroku, včetně operátora, asistentů, anesteziologa a sester, budou vědět o typu přidělené intervence. Kromě typu chirurgické techniky a nezávisle na náhodném přiřazení do jedné ze dvou větví studie budou všichni zahrnutí pacienti podrobeni hodnocení akumulace konečných produktů pokročilé glykace v kůži a kolagenu obecně, kolagenu typu I a typu III kolagenu v transversalis fascii za účelem vyhodnocení potenciálních souvislostí mezi těmito faktory a výskytem primárního koncového bodu. Analýzy vlivu typu chirurgické techniky použité pro uzávěr břicha, akumulace konečných produktů pokročilé glykace a obsahu kolagenu v transversalis fascii na riziko tvorby incizní kýly budou upraveny s ohledem na účinky zbývajících známých rizikových faktorů, včetně: věk, pohlaví, váha, výška, primární onemocnění jako indikace k výkonu, anamnéza předchozí kýly, anamnéza předchozích břišních operací, předoperační chemoterapie, kouření cigaret, nadměrný příjem alkoholu, přítomnost onemocnění jater, obezita, arteriální hypertenze, chronická obstrukční plicní onemocnění, srdeční selhání, anémie, rasa, šířka podkožní tukové tkáně, konkrétní typ a délka řezu, intraoperační transfuze červených krvinek a výskyt infekce v místě operace v pooperačním období.

Analýzy týkající se primárního koncového bodu studie budou provedeny 2 roky po datu chirurgického výkonu u posledního pacienta zařazeného do studijní kohorty. Navíc je plánována časná analýza pouze s ohledem na výskyt prasknutí břicha 30 dní po datu chirurgického výkonu u posledního pacienta zařazeného do studijní kohorty. Nezávisle na primárním cíli budou provedeny samostatné analýzy k vyhodnocení dopadu analyzovaných faktorů a výskytu incizních kýl na kvalitu života pacientů.

METODIKA VÝZKUMU Nábor pacientů do plánovaného výzkumného projektu bude probíhat na základě přísných inkluzních a vyřazovacích kritérií. Kritéria pro zařazení budou zahrnovat: věk nad 18 let, plánovanou operační léčbu zhoubného nádoru trávicího systému (včetně jater, žlučovodů a slinivky břišní) prostřednictvím příčné incize v epigastrické oblasti a poskytnutí informovaného souhlasu s účastí ve studii. Kritéria vyloučení budou zahrnovat: nutnost provedení urgentní operace, anamnézu předchozí operace provedené příčnou incizí v epigastrické oblasti a index tělesné hmotnosti > 35 kg/m2.

Po zařazení pacienta do studie budou provedena základní antropometrická měření (výška, váha a obvod pasu), spolu s fyzikálním vyšetřením a sběrem pacientovy anamnézy. Všechny lékařské dokumenty a další laboratorní, radiologické a jakékoli jiné typy nálezů budou analyzovány a shromážděny relevantní údaje, aby byly poskytnuty informace o dříve stanovených rizikových faktorech pro rozvoj incizní kýly. Všechna data budou shromažďována jak v papírové dokumentaci, tak jako záznamy ve vyhrazené elektronické databázi. V dalším kroku bude vyhodnocena akumulace konečných produktů pokročilé glykace v kůži předloktí pomocí nepřímé metody měření založené na hodnocení autofluorescence kůže. Tento jev je charakteristickým nálezem způsobeným přítomností několika konečných produktů pokročilé glykace a bylo zjištěno, že jeho kvantitativní hodnocení v kůži přesně odráží velikost akumulace pokročilé glykace a produktů obecně v jiných tkáních, což bylo dříve potvrzeno srovnáním kůže autofluorescenční nálezy s výsledky tkáňových biopsií [29]. Pro svůj neinvazivní charakter a spolehlivé výsledky bylo hodnocení akumulace konečných produktů pokročilé glykace metodou kvantitativního hodnocení autofluorescence kůže využíváno v řadě klinických studií po celém světě. V plánovaném výzkumném projektu bude kvantitativní měření autofluorescence kůže prováděno neinvazivním přístrojem, jehož použití bylo dříve ověřeno v klinickém prostředí (AGE-reader connect, www.diagnooptics.com, DiagnOptics BV, Groningen, Nizozemsko). V souladu s tím bude autofluorescence kůže excitována emisí ultrafialového (UV-A) světla o vlnové délce 375 nm (E=7,81E-01 Wm2 @ 0,2 m). Světlo vyzařované kůží bude měřeno pomocí systému založeného na fotodiodách. Výpočet libovolných jednotek provádí vyhrazený software zařízení. U každého pacienta budou provedena tři samostatná 12sekundová měření na přední straně předloktí přibližně 10 cm pod záhybem lokte, aby se snížilo potenciální riziko chyby měření. Konečná hodnota autofluorescence kůže bude průměrem skóre těchto 3 samostatných měření. Důležité je, že tento parametr bude hodnocen pouze u pacientů s kožními fototypy I, II a III podle Fitzpatrickovy klasifikace. Autofluorescence kůže bude také hodnocena během dvou pooperačních kontrolních návštěv po 1 a 2 letech.

V předoperačním období budou všichni pacienti podrobeni základnímu hodnocení kvality života. Proto budou všichni pacienti požádáni o vyplnění polské verze dotazníku kvality života core 30 (QLQ-C30) připraveného Evropskou organizací pro výzkum a léčbu rakoviny (EORTC). EORTC QLQ-C30 je široce používaný nástroj pro hodnocení kvality života pacientů se zhoubnými nádory, který se skládá z 30 otázek (nejaktuálnější třetí verze) a byl použit již ve více než 3 tisících klinických studií po celém světě ( http://groups.eortc.be/qol/eortc-qlq-c30). Je pozoruhodné, že verze dotazníku EORTC QLQ-C30 přeložená do polštiny již byla validována v klinickém prostředí. Dotazník poskytuje informace o celkem 15 výsledcích kvality života souvisejících se zdravím, včetně: fyzické funkce, funkce rolí, kognitivní funkce, emoční funkce, sociální funkce, únava, nevolnost a zvracení, bolest, dušnost, nespavost, ztráta chuti k jídlu, zácpa, průjem, finanční dopad a globální kvalita života. Pro účely této studie, jak konkrétní měření kvality života související se zdravím (se zvláštním ohledem na fyzické, emocionální a sociální funkce, bolest, finanční dopad a globální stupnice kvality života), tak souhrnné skóre odvozené z EORTC Bude analyzován dotazník QLQ-C30. Důležité je, že robustnost posledně jmenovaného byla nedávno prokázána replikací a validací modelů vyšších řádů Giesingerem a spolupracovníky.

V pooperačním období bude hodnocení kvality života související se zdravím prováděno při propuštění z nemocnice a při dvou kontrolních návštěvách za 1 a 2 roky po chirurgickém výkonu.

Pacienti budou náhodně zařazeni do jedné ze dvou technik uzávěru břicha během operačního výkonu a po ukončení jeho hlavní části, těsně před začátkem uzávěru dutiny břišní. Randomizace bude provedena v poměru 1:1 a v blocích po 20 pacientech. Tento postup náhodného přidělení provede sestra na operačním sále nakreslením zalepené obálky s kódem zásahu specifickým pro techniku. Před zahájením abdominálního uzávěru bude z transversalis fascie odebrán vzorek 5 x 5 mm pro další histopatologické analýzy obsahu kolagenu obecně a konkrétně obsahu kolagenu typu I a kolagenu typu III. Vzorky tkání budou fixovány ve 4% pufrovaném roztoku formalínu. Následně budou opláchnuty ve vodě a automaticky zpracovány přes 70%, 96% a absolutní roztoky etanolu, alkoholové a xylenové roztoky a řadu xylenů. Poté se vzorky zalijí do parafínu při teplotě 60 stupňů Celsia, aby se vytvořily tkáňové bloky. Ten bude nařezán na 3-4 mikrometry silné řezy pomocí mikrotomového zařízení. Řezy budou přeneseny na mikroskopická sklíčka. Nejprve bude provedeno barvení hematoxylinem a eosinem a sklíčka budou vyhodnocena na přiměřenost odebraného vzorku tkáně. Pro posouzení celkového obsahu kolagenu bude provedeno barvení Picrosirius Red a preparáty budou pozorovány pod mikroskopem spojeným s videokamerou. Počáteční hodnocení kolagenu typu I a kolagenu typu III bude hodnoceno pozorováním mikroskopických preparátů pod polarizovaným světlem. Podle metody navržené Casanovou a spolupracovníky bude celkový obsah kolagenu v získaném vzorku analyzován spočítáním poměru lomivých (kolagen-pozitivních) k nerefringentním (kolagen-negativním) plochám v 5 náhodně vybraných zorných polích pozorovaných při 100 zvětšení. Za účelem prvotního stanovení obsahu kolagenu typu I a typu III bude posouzeno dalších 5 náhodně vybraných zorných polí při zvětšení 400 s vyhodnocením lomených oblastí se sklonem k zelenému vzhledu, což je charakteristické pro kolagen typu III, a polí se sklonem k vypadají oranžově, což je charakteristické pro kolagen typu I. Ve všech případech budou konečné výsledky odvozeny z průměru výsledků z 5 kontrolovaných zorných polí. Elektronické snímky budou pořízeny a analyzovány v počítačovém softwaru pro zpracování obrazu. Vypočte se poměr kolagenu typu I k typu III.

Za účelem provedení konvenčního imunohistochemického barvení budou vzorky zbaveny parafinu pomocí xylenu, řady ethanolových roztoků s klesajícími koncentracemi a vody. Proces vyhledávání antigenu bude proveden v TRIS/EDTA pufru o pH 9. Endogenní peroxidáza bude blokována 3% roztokem peroxidu vodíku. Protein Block Serum-Free a 2,5% roztok oslího séra bude aplikováno k blokování nespecifických míst vazby antigenu. Detekce kolagenu typu I a typu III bude provedena pomocí specifických primárních protilátek proti kolagenu I a anti-kolagenu III v množství 200 ul na mikroskopické sklíčko. V dalším kroku budou použity sekundární protilátky kombinované s částicemi peroxidázy. Jako chromogen bude použit (3-3')diaminobenzidin (1 ml pufru s 1 kapkou substrátu), způsobující hnědé zbarvení imunopozitivních struktur. Basofilní struktury budou ilustrovány kontrastním barvením hematoxylinem. Vzorky pak budou dehydratovány řadou roztoků ethanolu, acetonu a xylenu se zvyšující se koncentrací (70 %, 96 % a 99,8 %). Po těchto postupech budou vzorky uzavřeny automatizovaným způsobem. Dále bude využita metoda dvojité imunofluorescence s použitím sekundárních protilátek kombinovaných s fluorochromy, médiem Vectashield a pozorováním v konfokálních a fluorescenčních mikroskopech.

Uzávěr dutiny břišní bude proveden jednou ze dvou analyzovaných chirurgických technik na základě výsledků náhodného přiřazení. Nezávisle na typu chirurgické techniky bude břišní uzávěr proveden polydioxanonovým materiálem (syntetický, monofilní a pomalu vstřebatelný) ve formě kličky, velikost 0 podle United States Pharmacopeia, a 36 mm jehlou. Tento materiál se vyznačuje účinnou tkáňovou retenční dobou 90 dnů a kompletní dobou vstřebání v rozmezí 182 až 238 dnů. V obou technikách budou mezery mezi stehy a zákusy tkáně 5 mm, což definuje metodu malých skusů. V případě přiřazení k technice hromadného uzávěru bude břišní dutina uzavřena jednou vrstvou 2 souvislých stehů začínajících na opačných koncích rány směrem ke střední čáře a zahrnujících peritoneum, transversalis fascii, zadní a přední vrstvu fascie rectus abdominis svalu a v případě řezů za laterální hranicí přímého břišního svalu také fascie šikmých břišních svalů. V případě přiřazení k technice vrstveného uzávěru bude břišní dutina uzavřena dvěma samostatnými vrstvami kontinuálních stehů. První vrstva bude zahrnovat pobřišnici, fascii transversalis a zadní vrstvu fascie přímého břišního svalu uzavřenou 2 souvislými stehy začínajícími na obou koncích rány a zpracovávanými mediálně. V případě řezů nepřesahujících laterální hranici přímého břišního svalu bude druhá vrstva 2 souvislých stehů zahrnovat pouze přední vrstvu fascie přímého břišního svalu začínající na laterálních koncích a vedenou mediálně. V případě řezů přesahujících laterální hranici přímého břišního svalu začne druhá vrstva kontinuálního stehu na laterální hranici přímého břišního svalu, probíhá laterálně k laterálnímu konci rány zahrnující vnitřní šikmou fascii břišního svalu. Následně bude steh vyveden na přední plochu zevního šikmého břišního svalu, prostrčen vytvořenou smyčkou mediálním směrem a zpracován mediálně k uzavření zevní fascie šikmého břišního svalu a přední vrstvy fascie přímého břišního svalu. Bez ohledu na použitou operační techniku ​​bude kontinuální zpracování stehů mediálně ukončeno za předpokladu, že z obou stran bude minimálně 2 cm dlouhý segment překrývajících se stehů. Kromě toho bude věnována pozornost uzavření pouze aponeuróz a vyloučení přítomnosti jakékoli svalové nebo tukové tkáně v stehech. Kůže bude uzavřena buď přerušovanými nevstřebatelnými stehy nebo staplerem.

Během operace bude měřeno a vyhodnocováno několik parametrů. Nejprve se změří hloubka podkožní tukové tkáně v centimetrech na třech místech: střední čára a bilaterálně, uprostřed mezi střední linií a laterálním koncem rány. Čas bude měřen od začátku uzávěru břicha do konce uzávěru aponeurózy. Délka rány bude měřena standardním způsobem v centimetrech. Délka sutury použité pro uzavření břicha bude posouzena odečtením délky stehů zbývajících po uzavření břicha od kumulativní původní délky stehů. Vypočte se poměr délky stehu k délce rány. Nakonec kvalitu břišní stěny s ohledem na potenciální riziko prasknutí břicha a incizní kýly subjektivně posoudí operující chirurg semikvantitativním způsobem pomocí následující škály: 1 - špatná kvalita, vysoké riziko; 2 - střední kvalita, průměrné riziko; 3 - dobrá kvalita, nízké riziko. Zahrnutí této proměnné do analýz rizikových faktorů může poskytnout určitý pohled na spolehlivost subjektivního hodnocení prasknutí břicha a incizní kýly operujícím chirurgem.

V bezprostředním pooperačním období (do propuštění pacienta z nemocnice) budou pacienti sledováni z hlediska rozvoje infekcí v místě chirurgického zákroku, definovaných a klasifikovaných podle doporučení CDC (Centers for Disease Control). Konkrétněji budou infekce v místě chirurgického zákroku rozděleny na povrchové incizní, hluboké incizní a orgánové/prostorové infekce. Každý operační výkon bude navíc klasifikován jako čistý, čistý-kontaminovaný, kontaminovaný a špinavý nebo infikovaný na základě typu operace a intraoperačních nálezů. Budou sbírány údaje o délce pooperační hospitalizace (ve dnech). Všechny komplikace stupně III nebo vyšší podle klasifikace Clavien-Dindo budou podrobně popsány. V případě reoperace z jiného důvodu, než je výskyt prasknutí břicha v bezprostředním pooperačním období, budou pozorování výskytu prasknutí břicha a incizní kýly cenzurována.

Všichni pacienti zařazení do studie budou pozváni ke dvěma kontrolním návštěvám po 1 a 2 letech (+/- 3 měsíce) po operačním výkonu, primárně k vyhodnocení přítomnosti incizní kýly. Při kontrolních návštěvách bude odebrána podrobná pooperační anamnéza pacienta, provede se fyzikální vyšetření a ultrasonografické vyšetření pooperační jizvy. Bez ohledu na to budou snímky z počítačové tomografie a/nebo magnetické rezonance provedené v rámci protokolů onkologického sledování (jediným doplňkovým zobrazovacím vyšetřením plánovaným v rámci tohoto výzkumného projektu je ultrasonografické vyšetření) posouzeny na přítomnost incizních kýla. Budou sbírány a analyzovány údaje o potenciálních diagnózách a léčbě incizních kýl před následnou návštěvou v jiných centrech, pokud taková situace nastane. Během každé z následných návštěv budou pacienti požádáni, aby vyplnili dotazníky EORTC QLQ-C30 a podstoupí měření autofluorescence kůže, jak bylo popsáno dříve.

Získaná data budou statisticky analyzována. Kvantitativní a kvalitativní data budou prezentována jako mediány s mezikvartilovými rozsahy a čísla s četnostmi. Pro meziskupinové srovnání kvalitativních proměnných bude použit Chí-kvadrát test a Fisherův exaktní test. Mann-Whitney U test bude aplikován pro meziskupinové srovnání kvantitativních proměnných. Základní analýza vztahu mezi typem chirurgické techniky použité pro uzávěr břicha a výskytem primárního cíle této studie bude provedena porovnáním křivek pravděpodobnosti pro přítomnost prasklé břišní dutiny a incizní kýly v čase do dvou let s log-rank testem. Analýzy souvislostí mezi zbývajícími faktory zahrnutými v této studii a výskytem primárního koncového bodu, jakož i analýzy více proměnných budou provedeny pomocí Coxových regresních modelů proporcionálních rizik. Stanovení optimálních mezních hodnot pro kvantitativní proměnné pro predikci vývoje incizních kýl bude založeno na analýze křivek operačních charakteristik přijímače a Youdenova indexu. Prvotní analýza zaměřená na rizikové faktory prasknutí břicha bude provedena pomocí Fisherova exaktního testu (chirurgická technika) a logistických regresních modelů (zbývající faktory a multivariabilní analýza). Hladina významnosti byla nastavena na 0,05 (oboustranná hodnota p). Plánuje se, že statistické analýzy budou vypočítány v softwaru STATISTICA (Dell Inc.) a SAS (SAS Institute).