Czynniki ryzyka rozwoju przepukliny pooperacyjnej w nacięciach poprzecznych

CELE PROJEKTU BADAWCZEGO Celem prezentowanego projektu naukowego jest ustalenie czynników, ze szczególnym uwzględnieniem rodzaju techniki operacyjnej, akumulacji tkankowej końcowych produktów zaawansowanej glikacji oraz zawartości kolagenu w powięzi poprzecznej, związanych z rozwojem przepukliny pooperacyjnej po cięciu poprzecznym w okolicy nadbrzusza u chorych operowanych z powodu nowotworów złośliwych PLAN PRACY Celem pracy jest prospektywna ocena czynników związanych z rozwojem przepuklin pooperacyjnych po cięciu poprzecznym w okolicy nadbrzusza u chorych leczonych chirurgicznie z powodu nowotworów złośliwych przewodu pokarmowego. Główną hipotezą tego badania, która stanowi podstawę do obliczeń liczebności próby, jest istnienie związku między zastosowaniem masowego ciągłego zamknięcia jamy brzusznej a zmniejszeniem ryzyka przepukliny pooperacyjnej z 35% do 20% w porównaniu z warstwowym szwem ciągłym . Przyjmując próg poziomu błędu I rzędu 0,05 i próg prawdopodobieństwa błędu II rodzaju na poziomie 20%, łączna liczba pacjentów, którzy powinni zostać włączeni do badania wynosi 284 (142 pacjentów w każdym 2 ramiona). Jednak biorąc pod uwagę przybliżoną wartość 2-letniego przeżycia pacjentów wynoszącą 20% i dalsze 10% odsetek strat do obserwacji, planuje się, że badanie obejmie łącznie 392 pacjentów (196 w obu ramionach).

Pierwszorzędowym punktem końcowym tego badania jest rozwój rozerwania brzucha w bezpośrednim okresie pooperacyjnym (do wypisu ze szpitala) lub przepukliny pooperacyjnej w ciągu 2-letniej obserwacji (złożony punkt końcowy). Protokół kontrolny zastosowany do oceny przepukliny pooperacyjnej przy wypisie ze szpitala i dwóch wizyt kontrolnych po 1 i 2 latach po operacji. Ocena obecności przepukliny pooperacyjnej będzie w każdym przypadku oparta zarówno na badaniu klinicznym, jak i badaniu ultrasonograficznym.

Podstawowym czynnikiem, który zostanie oceniony pod kątem potencjalnego związku z rozwojem przepuklin pooperacyjnych, jest technika chirurgiczna zastosowana do zamknięcia jamy brzusznej. Technika obejmująca szwy ciągłe i zamknięcie masy (jedna warstwa szwów obejmująca otrzewną, powięź poprzeczną, tylną i przednią warstwę powięzi mięśnia prostego brzucha i potencjalnie powięź mięśnia skośnego brzucha) zostanie porównana z techniką 2 oddzielnych warstw szwów ciągłych obejmujące odpowiednio otrzewną, powięź poprzeczną i tylną warstwę powięzi mięśnia prostego brzucha (pierwsza warstwa) i przednią warstwę powięzi mięśnia prostego brzucha oraz potencjalnie powięź mięśni skośnych brzucha (druga warstwa). Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednego z dwóch ramion w stosunku 1:1 na podstawie wylosowania zaklejonej koperty z kodem właściwym dla rodzaju interwencji. Ani pacjenci włączeni do badania, ani badacze oceniający obecność przepukliny pooperacyjnej podczas wizyt kontrolnych nie będą świadomi rodzaju techniki chirurgicznej zastosowanej do zamknięcia jamy brzusznej (badanie z podwójnie ślepą próbą).

Tylko profesjonaliści obecni na sali operacyjnej podczas zabiegu chirurgicznego, w tym operator, asystenci, anestezjolodzy i pielęgniarki, będą świadomi rodzaju przydzielonej interwencji. Oprócz rodzaju techniki chirurgicznej i niezależnie od losowego przydziału do jednej z dwóch ramion badania, wszyscy włączeni pacjenci zostaną poddani ocenie kumulacji produktów końcowych zaawansowanej glikacji w skórze i ogólnie kolagenu, kolagenu typu I i typu III kolagenu w obrębie powięzi poprzecznej w celu oceny potencjalnych związków między tymi czynnikami a wystąpieniem pierwotnego punktu końcowego. Analizy dotyczące wpływu rodzaju techniki chirurgicznej zastosowanej do zamknięcia jamy brzusznej, nagromadzenia końcowych produktów zaawansowanej glikacji oraz zawartości kolagenu w obrębie powięzi poprzecznej na ryzyko powstania przepukliny pooperacyjnej zostaną skorygowane o wpływ pozostałych znanych czynników ryzyka, w tym: wiek, płeć, waga, wzrost, choroba pierwotna będąca wskazaniem do zabiegu, przebyta przepuklina, przebyte operacje jamy brzusznej, chemioterapia przedoperacyjna, palenie papierosów, nadmierne spożycie alkoholu, obecność chorób wątroby, otyłość, nadciśnienie tętnicze, przewlekła obturacyjna choroba płuc, niewydolność serca, niedokrwistość, rasa, szerokość podskórnej tkanki tłuszczowej, rodzaj i długość nacięcia, śródoperacyjne przetoczenia koncentratu krwinek czerwonych, występowanie zakażenia miejsca operowanego w okresie pooperacyjnym.

Analizy dotyczące pierwszorzędowego punktu końcowego badania zostaną przeprowadzone po 2 latach od daty zabiegu chirurgicznego u ostatniego pacjenta zakwalifikowanego do badanej kohorty. Dodatkowo planowana jest wczesna analiza tylko pod kątem wystąpienia rozerwania brzucha po 30 dniach od daty zabiegu chirurgicznego u ostatniego pacjenta włączonego do badanej kohorty. Niezależnie od pierwszorzędowego punktu końcowego zostaną przeprowadzone odrębne analizy oceniające wpływ analizowanych czynników oraz występowanie przepuklin pooperacyjnych na jakość życia pacjentów.

METODOLOGIA BADAŃ Rekrutacja pacjentów do planowanego projektu badawczego odbywać się będzie w oparciu o ścisłe kryteria włączenia i wyłączenia. Kryteriami włączenia będą: wiek powyżej 18 lat, planowe leczenie operacyjne z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego (w tym wątroby, dróg żółciowych i trzustki) poprzez nacięcie poprzeczne w okolicy nadbrzusza oraz wyrażenie świadomej zgody na udział w badaniu. Kryteriami wykluczenia będą: konieczność wykonania pilnej operacji, przebyty wcześniej zabieg chirurgiczny z cięciem poprzecznym w okolicy nadbrzusza oraz wskaźnik masy ciała >35 kg/m2.

Po włączeniu pacjenta do badania zostaną wykonane podstawowe pomiary antropometryczne (wzrostu, masy ciała i obwodu pasa) wraz z badaniem przedmiotowym i zebraniem historii choroby pacjenta. Wszystkie dokumenty medyczne oraz dodatkowe wyniki badań laboratoryjnych, radiologicznych i innych będą analizowane i zbierane odpowiednie dane w celu uzyskania informacji o wcześniej ustalonych czynnikach ryzyka rozwoju przepukliny pooperacyjnej. Wszystkie dane będą gromadzone zarówno w formie dokumentacji papierowej, jak i zapisów w dedykowanej elektronicznej bazie danych. W kolejnym kroku dokonana zostanie ocena kumulacji produktów końcowych zaawansowanej glikacji w skórze przedramienia za pomocą pośredniej metody pomiarowej opartej na ocenie autofluorescencji skóry. Zjawisko to jest charakterystycznym odkryciem spowodowanym obecnością kilku produktów końcowych zaawansowanej glikacji, a jego ilościowa ocena w obrębie skóry wykazała, że ​​dokładnie odzwierciedla wielkość akumulacji zaawansowanej glikacji i produktów ogólnie w innych tkankach, co zostało wcześniej potwierdzone przez porównanie skóry wyniki autofluorescencji z wynikami biopsji tkanek [29]. Ze względu na nieinwazyjny charakter i wiarygodne wyniki ocena akumulacji produktów końcowych zaawansowanej glikacji metodą ilościowej oceny autofluorescencji skóry była wykorzystywana w wielu badaniach klinicznych na całym świecie. W planowanym projekcie badawczym wykonany zostanie ilościowy pomiar autofluorescencji skóry za pomocą nieinwazyjnego urządzenia, którego zastosowanie zostało wcześniej zwalidowane w warunkach klinicznych (AGE-reader connect, www.diagnoptics.com, DiagnOptics BV, Groningen, Holandia). Odpowiednio, autofluorescencja skóry zostanie wzbudzona przez emisję światła ultrafioletowego (UV-A) o długości fali 375 nm (E=7,81E-01 Wm2 @ 0,2 m). Światło emitowane w odpowiedzi przez skórę będzie mierzone za pomocą systemu opartego na fotodiodach. Obliczanie dowolnych jednostek odbywa się za pomocą dedykowanego oprogramowania urządzenia. U każdego pacjenta zostaną wykonane trzy oddzielne 12-sekundowe pomiary na przedniej stronie przedramienia, około 10 cm poniżej fałdu łokciowego, aby zmniejszyć potencjalne ryzyko błędu pomiaru. Ostateczna wartość autofluorescencji skóry będzie średnią z tych 3 oddzielnych pomiarów. Co ważne, parametr ten będzie oceniany tylko u pacjentów z fototypem skóry I, II i III według klasyfikacji Fitzpatricka. Autofluorescencja skóry będzie również oceniana podczas dwóch wizyt kontrolnych po operacji po 1 i 2 latach.

W okresie przedoperacyjnym wszyscy pacjenci zostaną poddani wstępnej ocenie jakości życia. W związku z tym wszyscy pacjenci zostaną poproszeni o wypełnienie polskiej wersji formularza kwestionariusza jakości życia core 30 (QLQ-C30) przygotowanego przez Europejską Organizację Badań i Leczenia Nowotworów (EORTC). EORTC QLQ-C30 to szeroko stosowane narzędzie do oceny jakości życia pacjentów z nowotworami złośliwymi, które składa się z 30 pytań (najbardziej aktualna wersja trzecia) i zostało już wykorzystane w ponad 3 tysiącach badań klinicznych na całym świecie ( http://groups.eortc.be/qol/eortc-qlq-c30). Warto zauważyć, że przetłumaczona na język polski wersja kwestionariusza EORTC QLQ-C30 została już zwalidowana w warunkach klinicznych. Kwestionariusz dostarcza informacji na temat łącznie 15 wyników jakości życia związanych ze zdrowiem, w tym: funkcji fizycznej, pełnionej roli, funkcji poznawczych, funkcji emocjonalnych, funkcji społecznych, zmęczenia, nudności i wymiotów, bólu, duszności, bezsenności, utraty apetytu, zaparć, biegunka, skutki finansowe i globalna jakość życia. Do celów tego badania zarówno poszczególne miary wyniku jakości życia związane ze zdrowiem (ze szczególnym uwzględnieniem funkcji fizycznych, emocjonalnych i społecznych, bólu, skutków finansowych i globalnych skal jakości życia), jak i sumaryczny wynik uzyskany z EORTC Kwestionariusz QLQ-C30 zostanie poddany analizie. Co ważne, solidność tego ostatniego została niedawno udowodniona przez replikację i walidację modeli wyższego rzędu przez Giesingera i współpracowników.

W okresie pooperacyjnym ocena jakości życia związanej ze stanem zdrowia zostanie przeprowadzona przy wypisie ze szpitala oraz podczas dwóch wizyt kontrolnych po 1 i 2 latach od zabiegu chirurgicznego.

Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch technik zamykania jamy brzusznej w trakcie zabiegu operacyjnego oraz po zakończeniu jego zasadniczej części, tuż przed rozpoczęciem zamykania jamy brzusznej. Randomizacja zostanie przeprowadzona w stosunku 1:1 iw blokach po 20 pacjentów. Ta procedura losowego przydziału zostanie przeprowadzona na sali operacyjnej przez pielęgniarkę poprzez losowanie zapieczętowanej koperty z kodem interwencji specyficznej dla danej techniki. Przed przystąpieniem do zabiegu zamknięcia jamy brzusznej z powięzi poprzecznej zostanie pobrany wycinek o wymiarach 5 x 5 mm do dalszych analiz histopatologicznych ogólnej zawartości kolagenu, aw szczególności zawartości kolagenu typu I i kolagenu typu III. Próbki tkanek zostaną utrwalone w 4% buforowanym roztworze formaliny. Następnie będą płukane w wodzie i automatycznie przetwarzane przez 70%, 96% i absolutne roztwory etanolu, roztwory alkoholu i ksylenu oraz szereg ksylenów. Następnie preparaty zostaną zatopione w parafinie w temperaturze 60 stopni Celsjusza w celu utworzenia bloczków tkankowych. Te ostatnie zostaną pocięte na skrawki o grubości 3-4 mikrometrów za pomocą urządzenia mikrotomowego. Skrawki zostaną przeniesione na szkiełka mikroskopowe. Najpierw zostanie przeprowadzone barwienie hematoksyliną i eozyną, a preparaty zostaną ocenione pod kątem adekwatności pobranej próbki tkanki. W celu oceny ogólnej zawartości kolagenu zostanie wykonane barwienie Picrosirius Red i obserwacja preparatów pod mikroskopem połączonym z kamerą wideo. Wstępna ocena kolagenu typu I i kolagenu typu III zostanie oceniona przez obserwację szkiełek mikroskopowych w świetle spolaryzowanym. Zgodnie z metodą zaproponowaną przez Casanovę i współpracowników, całkowita zawartość kolagenu w otrzymanej próbce zostanie przeanalizowana przez zliczenie stosunku obszarów refrencyjnych (kolagenowo dodatnich) do nieodblaskowych (kolagenoujemnych) w 5 losowo wybranych polach widzenia obserwowanych przy 100 powiększenie. W celu wstępnego ustalenia zawartości kolagenu typu I i typu III zostanie ocenionych dodatkowo 5 losowo wybranych pól widzenia przy powiększeniu 400 z oceną obszarów refrencyjnych wykazujących tendencję do zazieleniania, co jest charakterystyczne dla kolagenu typu III oraz tych, które mają tendencję do zazieleniania się. wyglądają na pomarańczowe, co jest charakterystyczne dla kolagenu typu I. We wszystkich przypadkach ostateczne wyniki będą pochodzić ze średniej wyników z 5 skontrolowanych pól widzenia. Obrazy elektroniczne zostaną wykonane i przeanalizowane w oprogramowaniu komputerowym do przetwarzania obrazu. Obliczony zostanie stosunek kolagenu typu I do kolagenu typu III.

W celu wykonania konwencjonalnych barwienia immunohistochemicznego próbki zostaną odparafinowane przy użyciu ksylenu, serii roztworów etanolu o malejących stężeniach oraz wody. Proces odzyskiwania antygenu zostanie przeprowadzony w buforze TRIS/EDTA o pH 9. Endogenna peroksydaza zostanie zablokowana 3% roztworem nadtlenku wodoru. Protein Block Serum-Free i 2,5% roztwór oślej surowicy zostaną zastosowane w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania antygenu. Wykrywanie kolagenu typu I i typu III zostanie przeprowadzone przy użyciu swoistych przeciwciał pierwszorzędowych, odpowiednio, anty-kolagen I i anty-kolagen III, w ilości 200 µl na szkiełko mikroskopowe. W kolejnym kroku zastosowane zostaną przeciwciała wtórne połączone z cząsteczkami peroksydazy. (3-3')diaminobenzydyna (1 ml buforu z 1 kroplą substratu) zostanie użyta jako chromogen, powodując brązowe zabarwienie struktur immunopozytywnych. Struktury zasadochłonne zostaną zilustrowane barwieniem kontrastowym hematoksyliną. Próbki zostaną następnie odwodnione za pomocą serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu (70%, 96% i 99,8%), acetonu i ksylenu. Po wykonaniu tych procedur próbki zostaną zamknięte w sposób zautomatyzowany. Dodatkowo wykorzystana zostanie metoda podwójnej immunofluorescencji z użyciem przeciwciał wtórnych połączonych z fluorochromami, podłożem Vectashield oraz obserwacja w mikroskopie konfokalnym i fluorescencyjnym.

Zamknięcie jamy brzusznej zostanie wykonane jedną z dwóch analizowanych technik operacyjnych, w oparciu o wyniki losowania. Niezależnie od rodzaju techniki chirurgicznej zamknięcie jamy brzusznej zostanie wykonane materiałem polidioksanonowym (syntetycznym, monofilamentowym, wolnowchłanialnym) w postaci pętli, rozmiar 0 według Farmakopei Stanów Zjednoczonych i igła 36 mm. Materiał ten charakteryzuje się efektywnym okresem retencji tkanek wynoszącym 90 dni oraz okresem całkowitej absorpcji w zakresie od 182 do 238 dni. W obu technikach odstępy między szwami i nacięcia tkanek będą wynosić 5 mm, co definiuje metodę małych nagryzów. W przypadku przydziału do techniki zamykania masy jama brzuszna zostanie zamknięta pojedynczą warstwą 2 ciągłych szwów rozpoczynających się na przeciwległych końcach rany w kierunku linii środkowej i obejmujących otrzewną, powięź poprzeczną, tylną i przednią warstwę powięzi mięśnia prostego brzucha aw przypadku nacięć poza boczną granicą mięśnia prostego brzucha również powięź mięśnia skośnego brzucha. W przypadku przydzielenia do techniki warstwowego zamykania jamy brzusznej zostaną zamknięte dwie oddzielne warstwy szwów ciągłych. Pierwsza warstwa będzie obejmowała otrzewną, powięź poprzeczną i tylną warstwę powięzi mięśnia prostego brzucha, zamkniętą 2 ciągłymi szwami rozpoczynającymi się na obu końcach rany i przetwarzanymi przyśrodkowo. W przypadku nacięć nieprzekraczających bocznej granicy mięśnia prostego brzucha druga warstwa 2 szwów ciągłych obejmie tylko przednią warstwę powięzi mięśnia prostego brzucha zaczynając od bocznych końców i przetwarzając przyśrodkowo. W przypadku nacięć przekraczających boczną granicę mięśnia prostego brzucha, druga warstwa szwu ciągłego rozpoczynać się będzie od bocznej granicy mięśnia prostego brzucha, przebiegać poprzecznie do bocznego końca rany obejmującej powięź mięśnia skośnego wewnętrznego brzucha. Następnie szew zostanie wyprowadzony na przednią powierzchnię mięśnia skośnego zewnętrznego brzucha, przeprowadzony przez utworzoną pętlę w kierunku przyśrodkowym i przetworzony przyśrodkowo w celu zamknięcia powięzi mięśnia skośnego zewnętrznego brzucha i przedniej warstwy powięzi mięśnia prostego brzucha. Niezależnie od zastosowanej techniki chirurgicznej szwy ciągłe przetwarzane przyśrodkowo zostaną zakończone pod warunkiem, że z obu stron zostanie zachowany odcinek szwów zachodzących na siebie o długości minimum 2 cm. Ponadto zwrócona zostanie uwaga, aby zamykać tylko rozcięgna i unikać obecności jakichkolwiek mięśni lub tkanki tłuszczowej w obrębie szwów. Skóra zostanie zamknięta przerywanymi niewchłanialnymi szwami lub zszywaczem.

Kilka parametrów zostanie zmierzonych i ocenionych śródoperacyjnie. Najpierw zostanie zmierzona głębokość podskórnej tkanki tłuszczowej w centymetrach w trzech miejscach: w linii środkowej i obustronnie, pośrodku między linią środkową a bocznym końcem rany. Czas będzie mierzony od początku zamknięcia jamy brzusznej do końca zamknięcia rozcięgna. Długość rany będzie mierzona w standardowy sposób w centymetrach. Długość szwu użytego do zamknięcia jamy brzusznej zostanie oceniona poprzez odjęcie długości szwów pozostałych po zamknięciu jamy brzusznej od łącznej pierwotnej długości szwów. Zostanie obliczony stosunek długości szwu do długości rany. Ostatecznie jakość powłoki brzusznej pod kątem potencjalnego ryzyka pęknięcia jamy brzusznej i przepukliny pooperacyjnej zostanie subiektywnie oceniona przez chirurga operującego w sposób półilościowy przy użyciu następującej skali: 1 - zła jakość, duże ryzyko; 2 - średnia jakość, średnie ryzyko; 3 - dobra jakość, niskie ryzyko. Włączenie tej zmiennej do analizy czynników ryzyka może dać pewien wgląd w wiarygodność subiektywnej oceny pękniętego brzucha i przepukliny pooperacyjnej przez chirurga operującego.

W bezpośrednim okresie pooperacyjnym (do wypisu pacjenta ze szpitala) pacjenci będą obserwowani pod kątem rozwoju infekcji miejsca operowanego, definiowanych i klasyfikowanych zgodnie z zaleceniami CDC (Centers for Disease Control). Mówiąc dokładniej, zakażenia miejsca operowanego zostaną podzielone na powierzchowne nacięcie, głębokie nacięcie i narządy/przestrzenie. Dodatkowo każda procedura operacyjna zostanie sklasyfikowana jako czysta, czysta-zanieczyszczona, skażona i brudna lub zakażona w zależności od rodzaju operacji i ustaleń śródoperacyjnych. Gromadzone będą dane dotyczące czasu trwania hospitalizacji pooperacyjnej (w dniach). Wszystkie powikłania stopnia III lub wyższego według klasyfikacji Clavien-Dindo zostaną szczegółowo opisane. W przypadku reoperacji z innej przyczyny niż wystąpienie rozerwania jamy brzusznej w bezpośrednim okresie pooperacyjnym, obserwacje dotyczące wystąpienia rozerwania jamy brzusznej i przepukliny pooperacyjnej będą cenzurowane.

Wszyscy pacjenci włączeni do badania zostaną zaproszeni na dwie wizyty kontrolne po roku i 2 latach (+/- 3 miesiące) po zabiegu operacyjnym, przede wszystkim w celu oceny obecności przepukliny pooperacyjnej. Podczas wizyt kontrolnych zostanie zebrany szczegółowy wywiad pooperacyjny pacjenta, wykonane zostanie badanie przedmiotowe oraz badanie ultrasonograficzne blizny pooperacyjnej. Niezależnie od tego obrazy tomografii komputerowej i/lub rezonansu magnetycznego wykonane w ramach protokołów kontroli onkologicznej (jedynym dodatkowym badaniem obrazowym planowanym w ramach tego projektu badawczego jest badanie ultrasonograficzne) będą oceniane pod kątem obecności przepuklina. Zbierane i analizowane będą dane dotyczące potencjalnych rozpoznań i leczenia przepuklin pooperacyjnych przed wizytą kontrolną w innych ośrodkach, jeśli taka sytuacja wystąpi. Podczas każdej z wizyt kontrolnych pacjenci będą proszeni o wypełnienie kwestionariuszy EORTC QLQ-C30 i zostaną poddani pomiarowi autofluorescencji skóry, jak opisano wcześniej.

Uzyskane dane zostaną poddane analizie statystycznej. Dane ilościowe i jakościowe zostaną przedstawione odpowiednio jako mediany z przedziałami międzykwartylowymi i liczby z częstością. Do porównań międzygrupowych zmiennych jakościowych zostaną użyte testy chi-kwadrat i dokładny test Fishera. Do międzygrupowych porównań zmiennych ilościowych zastosowany zostanie test U Manna-Whitneya. Wyjściowa analiza związku między rodzajem techniki chirurgicznej zastosowanej do zamknięcia jamy brzusznej a występowaniem pierwotnego punktu końcowego tego badania zostanie przeprowadzona poprzez porównanie krzywych prawdopodobieństwa wystąpienia pęknięcia jamy brzusznej i przepukliny pooperacyjnej w czasie do dwóch lat z testem log-rank. Analizy powiązań między pozostałymi czynnikami uwzględnionymi w tym badaniu a wystąpieniem pierwszorzędowego punktu końcowego oraz analizy wielozmienne zostaną przeprowadzone z wykorzystaniem modeli regresji proporcjonalnego hazardu Coxa. Ustalenie optymalnych wartości granicznych dla zmiennych ilościowych do prognozowania rozwoju przepuklin pooperacyjnych będzie oparte na analizie krzywych charakterystyk pracy odbiornika oraz wskaźnika Youdena. Wstępna analiza skupiająca się na czynnikach ryzyka pęknięcia brzucha zostanie przeprowadzona za pomocą dokładnego testu Fishera (technika chirurgiczna) i modeli regresji logistycznej (pozostałe czynniki i analiza wielu zmiennych). Poziom istotności ustalono na 0,05 (dwustronna wartość p). Przewiduje się wykonywanie analiz statystycznych w oprogramowaniu STATISTICA (Dell Inc.) oraz SAS (SAS Institute).