Predikce dilatace a ruptury aorty (DilAo)

1. Účel studie Účelem této studie je prozkoumat prognostické parametry dilatace aorty. Konkrétně jde o identifikaci prognostických zobrazovacích parametrů, které by mohly být použity k identifikaci pacientů s vysokým rizikem rychlé dilatace aorty a měly by být intenzivně sledovány zobrazovacími metodami.

2. Dílčí zkoušky

1. Klinická studie 1 Cílem první fáze studie je identifikovat průtokové parametry 4D MRI, které jsou charakteristické pro dilatovanou aortu a mohou být použity k hodnocení budoucí prognózy u pacientů s dilatací aorty nebo predisponujícími faktory.
2. Klinická studie 2 Druhá fáze studie si klade za cíl pomocí identifikovaných průtokových parametrů při sledování klinického zobrazování zjistit, které parametry predikují dilataci aorty v reálném životě, a mohly by tak být použity pro výběr pacientů pro intenzivnější zobrazování v budoucnu.
3. Studie 3 - Molekulární patologie, histologie a genetika aorty Cílem této části studie je zjistit rozdíly v molekulární biologii, histologii, elasticitě a genetice aorty u pacientů s predisponujícími faktory pro dilataci aorty. Budou studovány zejména buněčné faktory ovlivňující tvorbu pojivové tkáně a vrstvy hladkého svalstva cév.

3. Metody

1. Populace pacientů Všichni pacienti a zdraví dobrovolníci poskytnou písemný informovaný souhlas se studií. Etický výbor nemocničního okresu Severní Savo schválil proces.

Studie 1 První fáze studie bude zahrnovat dvacet pacientů s anatomickým nebo funkčním BAV nebo jiným onemocněním predisponujícím k dilataci aorty naplánované na rutinní MRI aorty na Radiologickém oddělení Fakultní nemocnice Kuopio (KUH). 4D průtoková MRI bude provedena hned po rutinní 2D MRI a prodlouží dobu zobrazování přibližně o 20 minut. Z výzkumné skupiny a personálu oddělení bude vybráno dvacet zdravých dobrovolných kontrol, které budou naplánovány na podobnou zobrazovací proceduru. Hlavní parametry analyzované z těchto jednorázových zobrazovacích dat jsou špičková rychlost proudění a excentricita proudění, vířivost proudění a smykové napětí stěny. V této studii budou také stanoveny parametry související s tuhostí a geometrií aorty. Bude provedeno srovnání 4D průtokových parametrů MRI mezi pacienty a zdravými kontrolami, 4D průtokové parametry budou také porovnány s konvenčními 2D průtokovými parametry jak u studovaných pacientů, tak u zdravých kontrol.

Studie 2 Pro následnou studii bude 100 pacientů vybráno stejným způsobem jako v případě pacientů z první studie. Kritéria pro zařazení budou: dospělý (věk > 18 let), dříve dokumentovaná dilatace aorty, dokumentovaná anatomická nebo funkční BAV nebo jiná dědičná porucha, která způsobuje zvýšené riziko dilatace aorty, bez kontraindikace pro MRI. Bude provedena podobná MRI aorty jako během klinické studie 1. Kontrolní zobrazení se však bude provádět po 6 měsících od první MRI a jednou ročně po dobu 5 let. Budou analyzovány stejné 4D a 2D parametry proudění jako v první studii. Zvláštní pozornost bude věnována stupni dilatace aorty a korelaci mezi 4D (a 2D) průtokovými parametry a rozměry aorty.

Klinické parametry Všichni pacienti navštěvující ambulanci budou mít klinické vyšetření (auskultace, klinické příznaky srdečního selhání, hepatomegalie, periferní edém, arteriální šelesty). Bude provedena 12svodová elektrokardiografie a základní laboratorní analýzy (hemoglobin, hematokrit, sodík, draslík, kreatinin, mozkový natriuretický peptid). S písemným souhlasem pacienta bude další zkumavka s krví uložena pro budoucí analýzu a pacient bude informován o účelu tohoto vzorku.

Echokardiografie Transthorakální echokardiografie bude provedena za použití rutinních klinických metod. Zvláštní pozornost bude věnována anatomii aortální chlopně a rozměrům aorty. Zaznamenány budou i další známky srdečních projevů. Budou hodnoceny komorové rozměry a objemové parametry a také komorová systolická a diastolická funkce.

Aorta MRI Magnetická rezonanční angiografie a 2D měření průtoku Statické zobrazení aorty se provádí sekvencí EKG a respiračně řízené 3D SSFP (steady state free percession) [Kawel et al 2012]. Zásobník snímků se získává v sagitální rovině a zpracovává se na pracovní stanici MPR, aby se získaly snímky kolmé k ose průtoku krve. Průměr aorty se měří od vnější stěny k vnější stěně. Určí se nejširší průměr aorty a rutinně se průměr aorty měří na 8 předem stanovených úrovních.

4D fázový kontrast MRI Průtok krve v aortě bude měřen na základě fázového kontrastu MRI. Měření bude provedeno opakováním sekvence zobrazovacích pulzů bez as gradienty vážení průtoku pro tři rozměry s prokládaným způsobem a měřením. Zobrazovací parametry budou nastaveny podle konsenzu 4D MRI měření průtoku [Dyverfelt 2015] v nejbližší době: rozlišení < 2,5x2,5x2,5 mm3, časové rozlišení 30 ms (časové rozlišení průtoku v různých srdečních fázích), retrospektivní synchronizace EKG a kompenzaci respiračního pohybu, úhel překlopení blízký Ernstovu úhlu a amplitudu gradientu vážení průtoku tak, aby maximální průtok byl o 10 % vyšší než očekávaná maximální průtoková rychlost v aortě. Zobrazovací objem bude pokrývat aortální chlopeň, aortální oblouk a sestupnou aortu na úrovni apexu myokardu. Data budou předzpracována, aby se minimalizoval příspěvek fázových posunů pozadí, nedokonalostí gradientu a fázových obalů.

Parametry toku Ze 4D tokových snímků bude extrahováno několik kvantitativních parametrů. Hlavní parametry jsou ty, které popisují rozložení proudění v aortě, tj. špičková rychlost a excentricita proudění, vířivost proudění a smykové napětí na stěnách cév. Dále bude zaznamenáno několik parametrů souvisejících s tuhostí aorty a geometrií a funkcí aortální chlopně. V průběhu sledování budou hodnoceny změny a prognostická hodnota kvantifikovaných parametrů.

Pro účely validace budou 4D parametry toku porovnány s parametry extrahovanými z konvenčních 2D sekvencí toku.

Protokol klinického sledování Pacienti přijatí do následné studie (studie 2) budou znovu vyšetřeni pomocí MRI aorty po půl roce od náboru a každý rok po první kontrolní návštěvě až do pěti let nebo podle klinického sledování plán. Pokud stav dilatace aorty naznačuje intenzivnější sledování, použije se intenzivnější sledování.

Statistické analýzy Prognostické faktory budou testovány na statistickou významnost porovnáním průtokových parametrů a souvisejících faktorů se stupněm dilatace aorty pomocí vhodné vícerozměrné analýzy. Statistická významnost bude nastavena na p < 0,05 a vysoká statistická významnost na p < 0,01. Data budou analyzována pomocí programu SPSS pro Windows.

Studium 3

Do třetího substudia bude zařazeno 20+100 pacientů s těžkou dilatací aorty plánovanou k operaci aorty. Vzorky lidské aorty se odebírají během rutinní operace náhrady aorty z odstraněné vaskulární tkáně. Kromě vzorků tkání bude odebrán vzorek krve pro genetickou a molekulární analýzu. Pacienti dali písemný souhlas s odběrem histologických vzorků a odběrů krve před operací. Po resekci jsou vzorky ihned přeneseny do tekutého dusíku (zmrazené vzorky), PFA-PBS (histologické vzorky) nebo do buněčného kultivačního média pro buněčnou izolaci (endoteliální buňky, buňky hladkého svalstva cév, fibroblasty). Zmrazené vzorky jsou skladovány při -70 °C a izolované buňky v kapalném dusíku. Histologické vzorky budou zpracovány do parafínu a uloženy jako parafínové bloky. Vzorky budou skladovány až 10 let a poté jsou zlikvidovány jako biologicky nebezpečný odpad. Nezpracovaná data budou uložena v elektrickém archivu, jako je European Genome-phenome Archive (EGA).

Analýzy Molekulární biologie a histologie vzorků aorty jsou vyšetřovány pomocí RT-qPCR, imunohistochemie a multifotonového mikroskopického zobrazování. Exprese relevantních genů, např. Studuje se TGF-β, rodina VEGF, COX-1 a 2, eNOS/Akt a prozánětlivé cytokiny a také sekvenování RNA, identifikující všechny exprimované mRNA současně, lze použít k nalezení rozdílů v expresi všech aortálních genů mezi různé skupiny pacientů. Gen FBN1 je sekvenován a hledá se mutace nebo delece.

Architektura cévní stěny aorty a exprese relevantních genů je vizualizována multifotonovou mikroskopií a imunohistochemií. Izolované buňky se používají pro analýzu jednotlivých buněk, která umožňuje studovat jednu živou buňku a její molekulární děje najednou a poskytuje zcela nové informace o funkcích různých buněk v cévní stěně. Získaná data jsou rozdělena do skupin odpovídajících onemocnění a věku a budou hledány korelace mezi stavem srdečního onemocnění, expresí aortálního genu a histologií aorty. Data budou také spojena a porovnána s preklinickou studií na myších popsanou v příloze 1 a studií 4D průtokového zobrazování lidské aorty MRI popsanou v odstavci 3.4.

Biomechanika histologických vzorků aorty Ze vzorků aorty budou měřeny biomechanické parametry jako je tuhost a pevnost při porušení. Měření a analýzy budou provedeny ve spolupráci se skupinou The BBC na University of Eastern Finland. Biomechanické parametry ve studovaných skupinách pacientů budou porovnány a použity jako parametr v multivariantních statistických analýzách. Výsledky budou také porovnány a propojeny s poznatky histologické a molekulární biologie.

Kontroly Vzorky pro srovnání s normální tkání budou odebrány od 10 dárců orgánů operovaných ve Fakultní nemocnici Kuopio. Se vzorky bude zacházeno tak, jak je popsáno u pacientů s aortou.

Matematické modelování aorty Zobrazovací data 20 pacientů budou anonymně zaslána do JAMK University of Applied Sciences pro matematické simulační modelování aortálního proudění a napětí stěny.

4. Spolupráce Klinická studie je vedena multiprofesionálně ve Fakultní nemocnici Kuopio společně s odděleními klinické kardiologie, kardiotorakální chirurgie (Heart Center) a radiologie (Clinical Imaging Center). Histopatologické, molekulární a genetické studie se provádějí na katedře molekulárních věd institutu A I Virtanen, University of Eastern Finland (UEF). Biomechanické testy budou probíhat na Katedře aplikované fyziky UEF. Matematické modelování aortálních obrazů bude prováděno na JAMK University of Applied Sciences. Získané výsledky průtoku 4D MRI budou analyzovány a validovány podle standardů Fakultní nemocnice Kuopio.