Przewidywanie poszerzenia i pęknięcia aorty (DilAo)

1. Cel badania Celem tego badania jest zbadanie parametrów prognostycznych poszerzenia aorty. Dokładniej, ma na celu identyfikację prognostycznych parametrów obrazowania, które mogłyby być wykorzystane do identyfikacji pacjentów z wysokim ryzykiem szybkiego poszerzenia aorty i które powinny być intensywnie monitorowane metodami obrazowania.

2. Podpróby

1. Badanie kliniczne 1 Celem pierwszej fazy badania jest identyfikacja parametrów przepływu w 4D MRI charakterystycznych dla poszerzonej aorty, które mogą posłużyć do oceny przyszłego rokowania u pacjentów z poszerzeniem aorty lub czynnikami predysponującymi.
2. Badanie kliniczne 2 Druga faza badania ma na celu wykorzystanie zidentyfikowanych parametrów przepływu w obrazowaniu klinicznym w celu ustalenia, które parametry przewidują poszerzenie aorty w prawdziwym życiu, a tym samym mogłyby zostać wykorzystane do selekcji pacjentów do bardziej intensywnego obrazowania w przyszłości.
3. Badanie 3 - Patologia molekularna, histologia i genetyka aorty Celem tej części pracy jest poznanie różnic w biologii molekularnej, histologii, elastyczności i genetyce aorty u pacjentów z czynnikami predysponującymi do poszerzenia aorty. W szczególności badane będą czynniki komórkowe wpływające na tworzenie tkanki łącznej i warstwy mięśni gładkich naczyń.

3. Metody

1. Populacja pacjentów Wszyscy pacjenci i zdrowi ochotnicy wyrażą pisemną świadomą zgodę na badanie. Komisja Etyczna Okręgu Szpitalnego Północnej Savo wydała zgodę na badanie.

Badanie 1 Pierwsza faza badania obejmie dwudziestu pacjentów z anatomiczną lub czynnościową BAV lub inną chorobą predysponującą do poszerzenia aorty, zakwalifikowanych do rutynowego rezonansu magnetycznego aorty w Oddziale Radiologii Szpitala Uniwersyteckiego w Kuopio (KUH). MRI przepływowe 4D zostanie wykonane zaraz po rutynowym MRI 2D i wydłuży czas obrazowania o około 20 minut. Z grupy badawczej i personelu wydziału zostanie zrekrutowanych dwudziestu zdrowych ochotników, którzy zostaną poddani podobnej procedurze obrazowania. Główne parametry analizowane na podstawie tych jednorazowych danych obrazowych to szczytowa prędkość przepływu i ekscentryczność przepływu, wirowość przepływu i naprężenie ścinające ściany. W badaniu zostaną również określone parametry związane ze sztywnością i geometrią aorty. Przeprowadzone zostanie porównanie parametrów przepływu 4D MRI pomiędzy pacjentami i zdrowymi kontrolami, parametry przepływu 4D zostaną również porównane z konwencjonalnymi parametrami przepływu 2D zarówno u badanych pacjentów, jak iu zdrowych osób kontrolnych.

Badanie 2 Do badania kontrolnego zostanie zrekrutowanych 100 pacjentów w taki sam sposób jak w przypadku pacjentów pierwszego badania. Kryteriami włączenia będą: osoba dorosła (wiek >18 lat), wcześniej udokumentowane poszerzenie aorty, udokumentowana anatomiczna lub czynnościowa BAV lub inna wrodzona wada, która powoduje zwiększone ryzyko poszerzenia aorty, brak przeciwwskazań do MRI. Zostanie wykonany podobny MRI aorty, jak podczas badania klinicznego 1. Jednak kontrolne badania obrazowe będą wykonywane po 6 miesiącach od pierwszego MRI i corocznie przez 5 lat. Analizowane będą te same parametry przepływu 4D i 2D, co w pierwszym badaniu. Szczególne zainteresowanie zostanie poświęcone stopniowi poszerzenia aorty oraz korelacji parametrów przepływu 4D (i 2D) z wymiarami aorty.

Parametry kliniczne Wszyscy pacjenci zgłaszający się do poradni będą poddani badaniu klinicznemu (osłuchiwanie, objawy kliniczne niewydolności serca, hepatomegalia, obrzęki obwodowe, szmery tętnicze). Wykonana zostanie elektrokardiografia 12-odprowadzeniowa oraz podstawowe badania laboratoryjne (hemoglobina, hematokryt, sód, potas, kreatynina, mózgowy peptyd natriuretyczny). Za pisemną zgodą pacjenta dodatkowa probówka krwi zostanie zachowana do przyszłej analizy, a pacjent zostanie poinformowany o przeznaczeniu tej próbki.

Echokardiografia Echokardiografia przezklatkowa zostanie przeprowadzona przy użyciu rutynowych metod klinicznych. Szczególne zainteresowanie zostanie poświęcone anatomii zastawki aortalnej i wymiarom aorty. Rejestrowane będą również inne objawy objawów sercowych. Oceniane będą wymiary i parametry objętościowe komór oraz czynność skurczowa i rozkurczowa komór.

MRI aorty Angiografia rezonansu magnetycznego i pomiary przepływu 2D Obrazowanie statyczne aorty wykonuje się za pomocą sekwencji 3D SSFP bramkowanej EKG i oddechem [Kawel i wsp. 2012]. Zestaw obrazów jest uzyskiwany w płaszczyźnie strzałkowej i przetwarzany na stacji roboczej MPR w celu uzyskania obrazów prostopadłych do osi przepływu krwi. Średnicę aorty mierzy się od ściany zewnętrznej do ściany zewnętrznej. Określa się najszerszą średnicę aorty i rutynowo mierzy się średnicę aorty na 8 wcześniej określonych poziomach.

MRI z kontrastem fazowym 4D Przepływ krwi w aorcie będzie mierzony na podstawie kontrastu fazowego MRI. Pomiar zostanie wykonany poprzez powtórzenie sekwencji impulsów obrazowania bez iz gradientami ważenia przepływu dla trzech wymiarów z przeplotem i pomiarem. Parametry obrazowania zostaną ustawione zgodnie z konsensusem dotyczącym pomiaru przepływu 4D MRI [Dyverfelt 2015] w skrócie: rozdzielczość < 2,5x2,5x2,5 mm3, rozdzielczość czasowa 30 ms (rozdzielczość czasowa w przepływie w różnych fazach serca), retrospektywna synchronizacja EKG i kompensacji ruchu oddechowego, kąt odchylenia zbliżony do kąta Ernsta i amplitudę gradientu ważenia przepływu tak, aby maksymalny przepływ był o 10% większy od oczekiwanego maksymalnego natężenia przepływu w aorcie. Objętość obrazowania obejmie zastawkę aortalną, łuk aorty oraz aortę zstępującą na poziomie wierzchołka mięśnia sercowego. Dane zostaną wstępnie przetworzone w celu zminimalizowania wpływu przesunięć faz tła, niedoskonałości gradientu i zawijania faz.

Parametry przepływu Z obrazów przepływu 4D zostanie wyodrębnionych kilka parametrów ilościowych. Głównymi parametrami są parametry opisujące rozkład przepływu w aorcie, tj. szczytowa prędkość i ekscentryczność przepływu, wirowość przepływu oraz naprężenia ścinające na ściankach naczynia. Ponadto zostanie zarejestrowanych kilka parametrów związanych ze sztywnością aorty oraz geometrią i funkcją zastawki aortalnej. Podczas obserwacji zostaną ocenione zmiany i wartość prognostyczna parametrów ilościowych.

W celu walidacji parametry przepływu 4D zostaną porównane z parametrami wyodrębnionymi z konwencjonalnych sekwencji przepływu 2D.

Protokół obserwacji klinicznej Pacjenci zrekrutowani do badania kontrolnego (badanie 2) zostaną ponownie poddani badaniu przesiewowemu za pomocą rezonansu magnetycznego aorty po pół roku od rekrutacji i raz w roku po pierwszej wizycie kontrolnej do pięciu lat lub zgodnie z obserwacją kliniczną harmonogram. Jeśli stan poszerzenia aorty wskazuje na to, że zostanie zastosowana bardziej intensywna obserwacja.

Analizy statystyczne Czynniki prognostyczne zostaną przetestowane pod kątem istotności statystycznej poprzez porównanie parametrów przepływu i powiązanych czynników ze stopniem poszerzenia aorty przy użyciu odpowiedniej analizy wieloczynnikowej. Istotność statystyczna zostanie ustalona na p<0,05, a wysoka istotność statystyczna na p<0,01. Dane zostaną przeanalizowane przy użyciu programu SPSS for Windows.

Studium 3

Trzecie badanie cząstkowe obejmie 20+100 pacjentów z ciężkim poszerzeniem aorty zakwalifikowanych do operacji aorty. Próbki ludzkiej aorty są pobierane podczas rutynowej operacji wymiany aorty z usuniętej tkanki naczyniowej. Oprócz próbek tkanek zostanie pobrana próbka krwi do analizy genetycznej i molekularnej. Pacjenci wyrazili pisemną zgodę na pobranie próbek histologicznych i krwi przed operacją. Po resekcji próbki są natychmiast przenoszone do ciekłego azotu (próbki zamrożone), PFA-PBS (próbki histologiczne) lub do pożywki do hodowli komórkowej w celu izolacji komórek (komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich naczyń, fibroblasty). Zamrożone próbki przechowuje się w temperaturze -70°C, a izolowane komórki w ciekłym azocie. Próbki histologiczne zostaną przetworzone na parafinę i przechowywane jako bloki parafinowe. Próbki będą przechowywane do 10 lat, po czym są niszczone jako odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Surowe dane będą przechowywane w archiwum elektrycznym, takim jak Europejskie Archiwum Genomu i Fenomu (EGA).

Analizy Biologia molekularna i histologia próbek aorty są badane za pomocą RT-qPCR, immunohistochemii i obrazowania w mikroskopie wielofotonowym. Ekspresja odpowiednich genów, np. Badane są TGF-β, rodzina VEGF, COX-1 i 2, eNOS/Akt i cytokiny prozapalne, a także sekwencjonowanie RNA, identyfikujące jednocześnie wszystkie ekspresjonowane mRNA, może być wykorzystane do znalezienia różnic w ekspresji wszystkich genów aorty między różne grupy pacjentów. Gen FBN1 jest sekwencjonowany i poszukiwany pod kątem mutacji lub delecji.

Architektura ściany naczynia aorty i ekspresja odpowiednich genów jest wizualizowana za pomocą mikroskopii wielofotonowej i immunohistochemii. Izolowane komórki są wykorzystywane do analizy pojedynczej komórki, która pozwala badać jedną żywą komórkę i jej zdarzenia molekularne w danym momencie oraz dostarcza zupełnie nowych informacji na temat funkcji różnych komórek w ścianie naczynia. Uzyskane dane podzielono na grupy pasujące do choroby i wieku, a także poszukiwano korelacji między stanem choroby serca, ekspresją genów aorty i histologią aorty. Dane zostaną również połączone i porównane z badaniem przedklinicznym na myszach opisanym w dodatku 1 oraz badaniem obrazowania przepływu MRI 4D ludzkiej aorty opisanym w punkcie 3.4.

Biomechanika histologicznych próbek aorty Na podstawie próbek aorty zostaną zmierzone parametry biomechaniczne, takie jak sztywność i wytrzymałość na zniszczenie. Pomiary i analizy zostaną przeprowadzone we współpracy z grupą BBC z Uniwersytetu Wschodniej Finlandii. Parametry biomechaniczne w badanych grupach pacjentów zostaną porównane i wykorzystane jako parametr w wielowariantowych analizach statystycznych. Wyniki zostaną również porównane i powiązane z odkryciami biologii histologicznej i molekularnej.

Kontrole Próbki do porównania z normalną tkanką zostaną pobrane od 10 dawców narządów operowanych w Szpitalu Uniwersyteckim w Kuopio. Z próbkami należy postępować zgodnie z opisem dla pacjentów z aortą.

Matematyczne modelowanie aorty Dane obrazowe 20 pacjentów zostaną przesłane anonimowo do JAMK University of Applied sciences w celu matematycznego modelowania symulacyjnego przepływu w aorcie i naprężeń ścian.

4. Współpraca Badanie kliniczne jest prowadzone wielospecjalistycznie w Szpitalu Uniwersyteckim w Kuopio wraz z oddziałami kardiologii klinicznej, kardiochirurgii (Centrum Serca) i radiologii (Clinical Imaging Center). Badania histopatologiczne, molekularne i genetyczne przeprowadzane są na Wydziale Nauk Molekularnych w A I Virtanen Institute, University of Eastern Finland (UEF). Badania biomechaniczne będą prowadzone w Zakładzie Fizyki Stosowanej w UEF. Modelowanie matematyczne obrazów aorty będzie wykonywane w PWSZ JAMK. Uzyskane wyniki przepływu 4D MRI zostaną przeanalizowane i zatwierdzone zgodnie ze standardami Szpitala Uniwersyteckiego w Kuopio.