Druhově specifický bakteriální detektor pro rychlou diagnostiku patogenů těžké pneumonie

U pacientů na JIP je vysoký výskyt bakteriálních infekcí v dolních cestách dýchacích, především s těžkým zápalem plic, často způsobujícím těžkou sepsi a septický šok, který je jednou z hlavních příčin úmrtí pacientů. V současnosti je největším problémem, kterému lékaři čelí, neustálý nárůst míry bakteriální rezistence a zvyšování mortality pacientů v důsledku časné nedostatečné empirické antiinfekční léčby. Studie ukázaly, že pacienti s VAP (Ventilator Associated Pneumonia) užívají drogy v raném stadiu iracionálně s úmrtností vyšší než 50 %. Když míra užívání vhodných drog klesla na 33 %, zatímco doba mechanické ventilace a doba hospitalizace na JIP se výrazně zkrátila. Pro zlepšení prognózy pacientů s těžkou pneumonií a snížení výskytu bakteriální rezistence je proto velmi důležitá co nejčasnější identifikace patogenů a zkrácení doby empirické protiinfekční léčby.

Existují tři tradiční metody detekce patogenních mikroorganismů: 1. metoda mikrobiální kultivace je nejtradičnějším prostředkem identifikace patogenu. Je nutné naočkovat pacientovu tělesnou tekutinu, krev atd. do vhodného média, inkubovat ve vhodném inkubátoru a poté lék podat. Testy citlivosti zjišťují odolnost mikroorganismů, obvykle trvá 3-7 dní. U některých specifických typů patogenních mikroorganismů nebo mikroorganismů s drsnými podmínkami růstu mohou být výsledky kultivace negativní. Proto mají tradiční kultivační metody nevýhody, jako je špatná včasnost, relativně vysoké požadavky a nízká míra pozitivní kultivace (30-40 %). 2. hmotnostní spektrometrie s dobou letu: technika hmotnostní spektrometrie se používá k analýze a detekci proteinových složek kmene a získává se charakteristické spektrum píku. Ve srovnání s bakteriální mapou v databázi lze bakterie posuzovat podle shody. Metoda může být zkrácena asi o 6-8 hodin ve srovnání s konvenční kultivační metodou, ale protože detekce kolonie musí dosáhnout určitého množství, nelze vzorek po získání vzorku přímo detekovat a předběžná mikrobiální kultivace je Požadované. Doba detekce tedy stále trvá 1-2 dny i více a nevýhodou je také nízká včasnost. Kromě toho je nutné porovnávat rozšíření a standardizaci databáze a nedostatkem detekční technologie je také nemožnost analýzy odolnosti mikroorganismů. 3. Technologie vysokokapacitního sekvenování: S rychlým rozvojem molekulární biologie v posledních letech je technologie vysokokapacitního sekvenování široce využívána v časné diagnostice klinické mikrobiologie, princip je především přes napojení univerzálního linkeru na fragmentaci až být řazeny. Genomová DNA, která produkuje desítky milionů jednomolekulárních polyklonálních polymerázových řetězových reakcí, poté provádí rozsáhlou hybridizaci primerů a enzymové extenzní reakce a počítačovou analýzou získává kompletní informace o sekvenci DNA. Tato technologie je však obtížné účinně rozlišovat mezi patogenními bakteriemi a bakteriemi na pozadí, technologie a databáze musí být standardizovány, doba detekce stále trvá asi 2 dny, nelze získat mikrobiální rezistenci, drahé a další nedostatky V kanceláři. Souhrnně lze říci, že aktuální časový limit pro cílenou protiinfekční léčbu je zastaven 2 dny po odběru vzorku. Hledání nové technologie detekce patogenních mikrobů, která by byla rychlejší, přesnější a citlivější, je proto v posledních letech hotspot a obtížný bod v oblasti mikrobiálního a protiinfekčního výzkumu.

CRISPR/Cas12a má trans-štěpící aktivitu, která by mohla být vyvinuta jako nová molekulární metoda pro testování specifických nukleotidových sekvencí s vysokou specificitou a citlivostí. Proto jsme iniciativně navrhli systém Species-Specific Bacterial Detector (SSBD) založený na CRISPR/Cas12a. Teoreticky je metoda prominentní svou rychlostí, vysokou senzitivitou a specificitou a variabilními cíli detekce, což je inovace v identifikaci mikroorganismů a může přinést výhody při léčbě sepse. Vzhledem k tomu, že některé konkrétní bakterie představují většinu sepse, bylo podle předchozích studií a údajů o lokální epidemii z naší nemocnice vybráno jako výchozí panel 12 běžných bakterií. Naším cílem studie je stanovit a ověřit účinnost systému SSBD porovnáním s výsledky kultivace a následně vyhodnotit možné klinické hodnoty v úpravě terapie a klinické výsledky těžké pneumonie na JIP, která byla hlavní příčinou sepse.