Artsspecifik bakteriedetektor til hurtig patogendiagnose af svær lungebetændelse

ICU-patienter har en høj forekomst af bakteriel infektion i de nedre luftveje, hovedsageligt med svær lungebetændelse, der ofte forårsager alvorlig sepsis og septisk shock, som er en af ​​de vigtigste dødsårsager hos patienter. På nuværende tidspunkt er den største vanskelighed for klinikere den kontinuerlige stigning i bakteriel resistensrate og stigningen i patientdødelighed på grund af den tidlige utilstrækkelighed empirisk anti-infektionsbehandling. Undersøgelser har vist, at patienter med VAP (Ventilator Associated Pneumonia) har irrationel stofbrug i det tidlige stadie med en dødelighed på mere end 50 %. Når antallet af passende stofbrug er faldet til 33 %, mens mekanisk ventilationstid og ICU indlæggelsestid er blevet væsentligt forkortet. Derfor er det meget vigtigt at identificere patogener så tidligt som muligt og afkorte tiden for empirisk anti-infektionsbehandling for at forbedre prognosen for patienter med svær lungebetændelse og reducere forekomsten af ​​bakteriel resistens.

Der er tre traditionelle metoder til påvisning af patogene mikroorganismer: 1. Mikrobiel dyrkningsmetode er det mest traditionelle middel til at identificere patogen. Det er nødvendigt at inokulere patientens kropsvæske, blod osv. i et passende medium, inkubere i en passende inkubator og derefter sende lægemidlet. Følsomhedstests bestemmer mikroorganismers resistens, tager normalt 3-7 dage. For nogle specifikke typer af patogene mikroorganismer eller mikroorganismer med barske vækstbetingelser kan der være negative dyrkningsresultater. Derfor har de traditionelle dyrkningsmetoder ulemper som dårlig aktualitet, relativt høje krav og lav positiv dyrkningsrate (30-40%). 2. time-of-flight massespektrometri: massespektrometri-teknikken bruges til at analysere og detektere stammens proteinkomponenter, og det karakteristiske topspektrum opnås. Sammenlignet med bakteriekortet i databasen kan bakterierne bedømmes ved matchning. Metoden kan forkortes med ca. 6-8 timer sammenlignet med den konventionelle dyrkningsmetode, men da påvisningen af ​​kolonien skal nå en vis mængde, kan prøven ikke påvises direkte efter prøvetagning, og den foreløbige mikrobielle kultur er påkrævet. Derfor tager detektionstiden stadig 1-2 dage eller mere, og der er også ulempen ved lav aktualitet. Derudover er det nødvendigt at sammenligne udvidelsen og standardiseringen af ​​databasen, og manglende evne til at analysere modstanden af ​​mikroorganismer er også utilstrækkeligheden af ​​detektionsteknologien. 3. High-throughput sekventeringsteknologi: Med den hurtige udvikling af molekylærbiologi i de senere år er high-throughput sekventeringsteknologi meget brugt i den tidlige diagnose af klinisk mikrobiologi, princippet er hovedsageligt gennem tilslutningen af ​​den universelle linker til fragmenteringen til blive sekvenseret. Genomisk DNA, som producerer titusinder af enkeltmolekyle polyklonale polymerasekædereaktionsarrays, udfører derefter storskala primerhybridisering og enzymforlængelse reaktioner og opnår fuldstændig DNA-sekvensinformation ved computeranalyse. Men denne teknologi er vanskeligt effektivt at skelne mellem patogene bakterier og baggrundsbakterier, teknologi og database skal standardiseres, detektionstiden tager stadig omkring 2 dage, kan ikke opnå mikrobiel resistens, dyre og andre mangler På kontoret. Sammenfattende stoppes den nuværende tidsfrist for målrettet anti-infektionsbehandling 2 dage efter prøvetagningen. Derfor er søgningen efter ny, patogen mikrobiel detektionsteknologi, der er hurtigere, mere præcis og mere følsom, et hotspot og et vanskeligt punkt inden for mikrobiel og anti-infektionsforskning i de senere år.

CRISPR/Cas12a har trans-spaltningsaktivitet, som kunne udvikles som en ny molekylær metode til test af specifikke nukleotidsekvenser med høj specificitet og sensitivitet. Vi har derfor initiativrigt designet det artsspecifikke bakterielle detektorsystem (SSBD) baseret på CRISPR/Cas12a. I teorien er metoden fremtrædende med hurtighed, høj sensitivitet og specificitet og variable detektionsmål, hvilket er en nyskabelse inden for mikroorganismeidentifikation og måske giver fordele til sepsisbehandling. Da nogle særlige bakterier står for det meste af sepsis, er 12 almindelige bakterier valgt som det indledende panel ifølge tidligere undersøgelser og lokale epidemiske data fra vores hospital. Vores mål med undersøgelsen er at etablere og validere effektiviteten af ​​SSBD-systemet ved at sammenligne med dyrkningsresultater og derefter evaluere de mulige kliniske værdier i terapijusteringer og kliniske resultater af svær lungebetændelse på intensivafdeling, som var hovedårsagerne til sepsis.