Lajikohtainen bakteeritunnistin vaikean keuhkokuumeen nopeaan patogeenien diagnosointiin

Tehohoitopotilailla on suuri ilmaantuvuus alempien hengitysteiden bakteeri-infektioihin, pääasiassa vaikeaan keuhkokuumeeseen, joka aiheuttaa usein vakavan sepsiksen ja septisen shokin, joka on yksi potilaiden tärkeimmistä kuolinsyistä. Tällä hetkellä suurin kliinikoiden kohtaama vaikeus on bakteerien vastustuskyvyn jatkuva kasvu ja potilaiden kuolleisuuden kasvu johtuen varhaisesta riittämättömyydestä empiirisen infektionvastaisen hoidon vuoksi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että VAP (Ventilator Associated Pneumonia) -potilailla on irrationaalinen huumeiden käyttö varhaisessa vaiheessa, ja kuolleisuus on yli 50 %. Kun tarkoituksenmukaisen huumeiden käyttöaste on pudonnut 33 prosenttiin, kun taas koneellinen hengitysaika ja teho-osaston sairaalahoitoaika ovat lyhentyneet merkittävästi. Siksi taudinaiheuttajien mahdollisimman varhainen tunnistaminen ja empiirisen infektionvastaisen hoidon ajan lyhentäminen ovat erittäin tärkeitä vaikeasta keuhkokuumeesta kärsivien potilaiden ennusteen parantamiseksi ja bakteeriresistenssin ilmaantuvuuden vähentämiseksi.

Patogeenisten mikro-organismien havaitsemiseen on kolme perinteistä menetelmää: 1. Mikrobiviljelymenetelmä on perinteisin tapa tunnistaa taudinaiheuttaja. Potilaan kehon neste, veri jne. on rokotettava sopivassa väliaineessa, inkuboitava sopivassa inkubaattorissa ja sitten lääkitys. Herkkyystesteillä määritetään mikro-organismien vastustuskyky, kestää yleensä 3-7 päivää. Joillekin tietyntyyppisille patogeenisille mikro-organismeille tai mikro-organismeille, joilla on ankarat kasvuolosuhteet, viljelytulokset voivat olla negatiivisia. Siksi perinteisillä viljelymenetelmillä on haittoja, kuten huono ajantasaisuus, suhteellisen korkeat vaatimukset ja alhainen positiivinen viljelyaste (30-40 %). 2. Lentoajan massaspektrometria: massaspektrometriaa käytetään kannan proteiinikomponenttien analysointiin ja havaitsemiseen, jolloin saadaan tunnusomainen huippuspektri. Verrattuna tietokannan bakteerikarttaan, bakteerit voidaan arvioida vastaavuudella. Menetelmää voidaan lyhentää noin 6-8 tunnilla tavanomaiseen viljelymenetelmään verrattuna, mutta koska pesäkkeen havaitsemisen on saavutettava tietty määrä, näytettä ei voida suoraan havaita näytteenoton jälkeen ja alustava mikrobiviljely on edellytetään. Siksi havaitsemisaika kestää edelleen 1-2 päivää tai enemmän, ja haittapuolena on myös alhainen oikea-aikaisuus. Lisäksi on tarpeen verrata tietokannan laajenemista ja standardointia, ja kyvyttömyys analysoida mikro-organismien vastustuskykyä on myös havaitsemistekniikan riittämättömyys. 3. Korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikka: Molekyylibiologian nopean kehityksen myötä viime vuosina korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikkaa käytetään laajalti kliinisen mikrobiologian varhaisessa diagnosoinnissa, periaate on pääasiassa yhdistämällä universaali linkkeri pirstoutumiseen olla järjestyksessä. Genominen DNA, joka tuottaa kymmeniä miljoonia yksimolekyylisiä polyklonaalisia polymeraasiketjureaktioryhmiä, suorittaa sitten laajamittaisia ​​alukehybridisaatio- ja entsyymipidennysreaktioita ja saa täydelliset DNA-sekvenssitiedot tietokoneanalyysillä. Tämä tekniikka on kuitenkin vaikea erottaa tehokkaasti patogeeniset bakteerit ja taustabakteerit, teknologia ja tietokanta on standardoitava, havaitsemisaika kestää vielä noin 2 päivää, ei voi saada mikrobien vastustuskykyä, kalliita ja muita puutteita Toimistolla. Yhteenvetona voidaan todeta, että nykyinen kohdennetun infektionvastaisen hoidon aikaraja pysähtyy 2 päivää näytteen ottamisen jälkeen. Siksi uuden, nopeamman, tarkemman ja herkemmän patogeenisten mikrobien havaitsemisteknologian etsintä on viime vuosien hotspot ja vaikea kohta mikrobien ja infektioiden vastaisen tutkimuksen alalla.

CRISPR/Cas12a:lla on trans-katkaisuaktiivisuutta, joka voitaisiin kehittää uudeksi molekyylimenetelmäksi spesifisten nukleotidisekvenssien testaamiseen, joilla on korkea spesifisyys ja herkkyys. Suunnittelimme näin oma-aloitteisesti lajikohtaisen bakteerien ilmaisin (SSBD) -järjestelmän, joka perustuu CRISPR/Cas12a:han. Teoriassa menetelmä on näkyvä nopeudellaan, korkealla herkkyydellä ja spesifisyydellä sekä vaihtelevilla havaitsemiskohteilla, mikä on innovaatio mikro-organismien tunnistamisessa ja saattaa tuoda hyötyä sepsiksen hoidossa. Koska jotkin tietyt bakteerit aiheuttavat suurimman osan sepsiksestä, 12 yleistä bakteeria valitaan alkupaneeliksi aikaisempien tutkimusten ja sairaalamme paikallisten epidemioiden mukaan. Tutkimuksen tavoitteena on vahvistaa ja validoida SSBD-järjestelmän tehokkuus viljelytuloksiin vertaamalla ja arvioida sen jälkeen mahdollisia kliinisiä arvoja hoidon säätämisessä ja vakavan keuhkokuumeen kliinisiä tuloksia teho-osastolla, joka oli sepsiksen tärkein syy.