Speziesspezifischer Bakteriendetektor zur schnellen Erregerdiagnose schwerer Lungenentzündungen

Bei Intensivpatienten kommt es häufig zu bakteriellen Infektionen der unteren Atemwege, vor allem mit schwerer Lungenentzündung, die oft zu schwerer Sepsis und septischem Schock führen, was eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist. Die größte Schwierigkeit, mit der Ärzte derzeit konfrontiert sind, ist der kontinuierliche Anstieg der bakteriellen Resistenzrate und der Anstieg der Patientensterblichkeit aufgrund der frühen Unzulänglichkeit der empirischen antiinfektiösen Behandlung. Studien haben gezeigt, dass Patienten mit VAP (Ventilator Associated Pneumonia) im Frühstadium irrationalen Drogenkonsum haben, mit einer Sterblichkeitsrate von mehr als 50 %. Die Rate des angemessenen Drogenkonsums ist auf 33 % gesunken, während die Dauer der maschinellen Beatmung und die Dauer des Krankenhausaufenthalts auf der Intensivstation deutlich verkürzt wurden. Daher sind die möglichst frühzeitige Identifizierung von Krankheitserregern und die Verkürzung der Zeit der empirischen antiinfektiösen Behandlung von großer Bedeutung, um die Prognose von Patienten mit schwerer Lungenentzündung zu verbessern und das Auftreten bakterieller Resistenzen zu verringern.

Es gibt drei traditionelle Methoden zum Nachweis pathogener Mikroorganismen: 1. Die mikrobielle Kulturmethode ist das traditionellste Mittel zur Identifizierung von Krankheitserregern. Es ist notwendig, die Körperflüssigkeit, das Blut usw. des Patienten in ein geeignetes Medium zu inokulieren, in einem geeigneten Inkubator zu inkubieren und dann das Medikament weiterzugeben. Sensitivitätstests bestimmen die Resistenz von Mikroorganismen und dauern in der Regel 3-7 Tage. Bei bestimmten Arten pathogener Mikroorganismen oder Mikroorganismen mit schwierigen Wachstumsbedingungen kann es zu negativen Kulturergebnissen kommen. Daher haben die traditionellen Kulturmethoden Nachteile wie eine schlechte Aktualität, relativ hohe Anforderungen und eine niedrige positive Kulturrate (30–40 %). 2. Flugzeit-Massenspektrometrie: Mithilfe der Massenspektrometrietechnik werden die Proteinkomponenten des Stamms analysiert und nachgewiesen und das charakteristische Peakspektrum erhalten. Durch Vergleich mit der Bakterienkarte in der Datenbank können die Bakterien durch Abgleich beurteilt werden. Die Methode kann im Vergleich zur herkömmlichen Kulturmethode um etwa 6 bis 8 Stunden verkürzt werden. Da jedoch der Nachweis der Kolonie eine bestimmte Menge erreichen muss, kann die Probe nicht direkt nach Erhalt der Probe nachgewiesen werden, sondern die vorläufige mikrobielle Kultur erforderlich. Daher beträgt die Erkennungszeit immer noch 1-2 Tage oder mehr, und es besteht auch der Nachteil einer geringen Aktualität. Darüber hinaus ist es notwendig, die Erweiterung und Standardisierung der Datenbank zu vergleichen, und die Unfähigkeit, die Resistenz von Mikroorganismen zu analysieren, ist auch auf die Unzulänglichkeit der Nachweistechnologie zurückzuführen. 3. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie: Mit der rasanten Entwicklung der Molekularbiologie in den letzten Jahren wird die Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie häufig in der Frühdiagnose der klinischen Mikrobiologie eingesetzt. Das Prinzip besteht hauptsächlich darin, den universellen Linker mit der Fragmentierung zu verbinden sequenziert werden. Genomische DNA, die zig Millionen Einzelmolekül-Polyklonale-Polymerase-Kettenreaktionsarrays produziert, führt dann groß angelegte Primerhybridisierungs- und Enzymverlängerungsreaktionen durch und erhält durch Computeranalyse vollständige DNA-Sequenzinformationen. Diese Technologie ist jedoch schwierig, effektiv zwischen pathogenen Bakterien und Hintergrundbakterien zu unterscheiden, Technologie und Datenbank müssen standardisiert werden, die Erkennungszeit dauert immer noch etwa 2 Tage, es kann keine mikrobielle Resistenz erreicht werden, es sind teuer und andere Mängel im Büro. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die derzeitige Frist für eine gezielte antiinfektiöse Behandlung 2 Tage nach der Probenentnahme gestoppt wird. Daher ist die Suche nach einer neuen Technologie zum Nachweis pathogener Mikroben, die schneller, genauer und empfindlicher ist, in den letzten Jahren ein Hotspot und ein schwieriger Punkt auf dem Gebiet der mikrobiellen und antiinfektiösen Forschung.

CRISPR/Cas12a verfügt über eine Transspaltungsaktivität, die als neue molekulare Methode zum Testen spezifischer Nukleotidsequenzen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit entwickelt werden könnte. Daher haben wir initiativ das auf CRISPR/Cas12a basierende Species-Specific Bacterial Detector (SSBD)-System entwickelt. Theoretisch zeichnet sich die Methode durch Schnelligkeit, hohe Empfindlichkeit und Spezifität sowie variable Nachweisziele aus, was eine Innovation bei der Identifizierung von Mikroorganismen darstellt und möglicherweise Vorteile für die Sepsisbehandlung mit sich bringt. Da einige bestimmte Bakterien für den Großteil der Sepsis verantwortlich sind, werden anhand früherer Studien und lokaler Epidemiedaten aus unserem Krankenhaus 12 häufig vorkommende Bakterien als Ausgangsgruppe ausgewählt. Unser Ziel der Studie ist es, die Wirksamkeit des SSBD-Systems durch Vergleich mit Kulturergebnissen zu ermitteln und zu validieren und anschließend die möglichen klinischen Werte bei Therapieanpassungen und klinischen Ergebnissen schwerer Lungenentzündung auf der Intensivstation, die die Hauptursache für Sepsis war, zu bewerten.