Vliv PCR-CRISPR/Cas12a na časná protiinfekční schémata u pacientů s pneumonií na otevřeném vzduchu

U pacientů na JIP je vysoký výskyt bakteriálních infekcí v dolních cestách dýchacích, především s těžkým zápalem plic, často způsobujícím těžkou sepsi a septický šok, který je jednou z hlavních příčin úmrtí pacientů. V současnosti je největším problémem, kterému lékaři čelí, neustálý nárůst míry bakteriální rezistence a zvyšování mortality pacientů v důsledku časné nedostatečné empirické antiinfekční léčby. Studie ukázaly, že pacienti s VAP (Ventilator Associated Pneumonia) užívají drogy v raném stadiu iracionálně s úmrtností vyšší než 50 %. Když míra užívání vhodných drog klesla na 33 %, zatímco doba mechanické ventilace a doba hospitalizace na JIP se výrazně zkrátila. Pro zlepšení prognózy pacientů s těžkou pneumonií a snížení výskytu bakteriální rezistence je proto velmi důležitá co nejčasnější identifikace patogenů a zkrácení doby empirické protiinfekční léčby.

Existují tři tradiční metody detekce patogenních mikroorganismů: 1. metoda mikrobiální kultivace je nejtradičnějším prostředkem identifikace patogenu. Je nutné naočkovat pacientovu tělesnou tekutinu, krev atd. do vhodného média, inkubovat ve vhodném inkubátoru a poté lék podat. Testy citlivosti zjišťují odolnost mikroorganismů, obvykle trvá 3-7 dní. U některých specifických typů patogenních mikroorganismů nebo mikroorganismů s drsnými podmínkami růstu mohou být výsledky kultivace negativní. Proto mají tradiční kultivační metody nevýhody, jako je špatná včasnost, relativně vysoké požadavky a nízká míra pozitivní kultivace (30-40 %). 2. hmotnostní spektrometrie s dobou letu: technika hmotnostní spektrometrie se používá k analýze a detekci proteinových složek kmene a získává se charakteristické spektrum píku. Ve srovnání s bakteriální mapou v databázi lze bakterie posuzovat podle shody. Metoda může být zkrácena asi o 6-8 hodin ve srovnání s konvenční kultivační metodou, ale protože detekce kolonie musí dosáhnout určitého množství, nelze vzorek po získání vzorku přímo detekovat a předběžná mikrobiální kultivace je Požadované. Doba detekce tedy stále trvá 1-2 dny i více a nevýhodou je také nízká včasnost. Kromě toho je nutné porovnávat rozšíření a standardizaci databáze a nedostatkem detekční technologie je také nemožnost analýzy odolnosti mikroorganismů. 3. Technologie vysokokapacitního sekvenování: S rychlým rozvojem molekulární biologie v posledních letech je technologie vysokokapacitního sekvenování široce využívána v časné diagnostice klinické mikrobiologie, princip je především přes napojení univerzálního linkeru na fragmentaci až být řazeny. Genomová DNA, která produkuje desítky milionů jednomolekulárních polyklonálních polymerázových řetězových reakcí, poté provádí rozsáhlou hybridizaci primerů a enzymové extenzní reakce a počítačovou analýzou získává kompletní informace o sekvenci DNA. Tato technologie je však obtížné účinně rozlišovat mezi patogenními bakteriemi a bakteriemi na pozadí, technologie a databáze musí být standardizovány, doba detekce stále trvá asi 2 dny, nelze získat mikrobiální rezistenci, drahé a další nedostatky V kanceláři. Souhrnně lze říci, že aktuální časový limit pro cílenou protiinfekční léčbu je zastaven 2 dny po odběru vzorku. Hledání nové technologie detekce patogenních mikrobů, která by byla rychlejší, přesnější a citlivější, je proto v posledních letech hotspot a obtížný bod v oblasti mikrobiálního a protiinfekčního výzkumu.

Kombinovaná technologie alveolární lavážní tekutiny PCR-CRISPR/Cas12a vyvinutá College of Life Sciences Univerzity Nanjing je založena na PCR amplifikaci a detekci fluorescenčního signálu dvakrát, aby bylo dosaženo detekce přítomnosti a nepřítomnosti specifických sekvencí DNA v testovaném vzorku. technika. Stanovení výsledku detekce patogenu klinického vzorku je založeno na porovnání výsledků fluorescence PCR produktu vzorku DNAD s výsledky fluorescenční detekce pozitivní kontroly (PC) a negativní kontroly (NC) jako standardu. . Specifická rozpoznávací funkce systému CRISPR/Cas12a závisí na specifickém vedení a vazbě crRNA na specifickou DNA a specifita crRNA je určena detekcí pozitivní kontroly běžného patogenu jedinou crRNA. Technologie detekce je vysoce specifická a trvá pouze 2-3 hodiny, což je kvalitativní skok v době detekce ve srovnání s konvenční technologií.

Za účelem ověření proveditelnosti a přesnosti technologie, Centrum a Nanjing University of Life Sciences pro běžné patogeny pneumonie na JIP (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa atd.) pro alveolární Kombinovaná detekční technika PCR-CRISPR/Cas12a pro lavážní tekutinu. 29 vzorků tekutiny z alveolární laváže dolních cest dýchacích bylo kultivováno konvenční bakteriální kultivační metodou a kombinováno s PCR-CRISPR/Cas12a. Výsledky ukázaly, že přesnost detekce a identifikace patogenů na základě technologie PCR-Cas12a dosáhla 93,10 % (27/29). U 27 vzorků lze pomocí technologie PCR-CRISPR/Cas12a detekovat patogeny infikované tradiční metodou izolace. Dvěma výjimkami byl průkaz Acinetobacter baumannii ve vzorku č. 6 tradiční metodou izolační kultivace a průkaz Proteus mirabilis ve vzorku č. 13 (není v rozsahu detekovaných patogenů). Kromě toho byly patogeny identifikované kombinační technikou PCR-CRISPR/Cas12a více než jeden nebo dva odlišné od tradičních kultivačních metod, což bylo v souladu s PCR, což naznačuje, že citlivost je mnohem vyšší než u konvenční mikrobiální kultury. výsledky jsou spolehlivé. Tyto předběžné výsledky naznačují, že kombinovaná detekční technika PCR-CRISPR/Cas12a má dobrou přesnost a vysokou citlivost.

Na základě toho výzkumný tým spekuloval, že kombinace PCR a detekční technologie CRISPR/Cas12a tekutiny z alveolární laváže k vedení protiinfekční léčby pacientů s pneumonií může dosáhnout cílené protiinfekční léčby a zlepšit prognózu pacientů. Abychom potvrdili výše uvedenou hypotézu, navrhli jsme multicentrickou randomizovanou prospektivní studii porovnávající účinky kombinované detekce PCR-CRISPR/Cas12a s tekutinou z alveolární laváže a tradičními technikami mikrobiální detekce na antimikrobiální úpravu a prognózu u pacientů s pneumonií na JIP. Jejím cílem je najít rychlejší, přesnější a citlivější technologii detekce mikrobů pro pacienty s pneumonií a dosáhnout dřívější precizní léčby.