Studium ekologické a evoluční dynamiky Escherichia Coli v trávicí komensální flóře (EVE)

Escherichia Coli představuje velký problém veřejného zdraví. E. coli není jen komenzál trávicího traktu, ale také hlavní oportunní patogen, první příčina infekcí močových cest, první příčina bakteriémie. O dynamice střevní kolonizace lidského hostitele je však známo jen málo. Pochopení dynamiky kolonizace je zásadní, protože selekce pro hlavní rysy E. coli je rezistence na antibiotika a virulence (sklon k vyvolání infekce) funguje v komenzalismu, ve střevě, ne v infekcích. Tato studie poprvé umožní studovat dynamiku kolonizace E. coli ve velké populaci zdravých hostitelů. Zejména budeme kvantifikovat, jak závisí ztráta nebo zisk určitých kmenů ve střevě na vlastnostech hostitele a bakterií. Tato studie tak umožní lépe porozumět epidemiologické dynamice E. coli a vývoji určitých znaků, jako je rezistence na antibiotika.

Hlavní cíl a kritérium Hlavním cílem tohoto výzkumu je kvantifikovat sukcesi (přírůstek, ztrátu nebo nahrazení) kmenů E. coli ve střevní mikrobiotě u zdravých dobrovolníků.

Sekundární cíle a kritéria Sekundárním cílem je studovat evoluci E. coli uvnitř hostitele se zaměřením na evoluci klonů kolonizujících stejného hostitele po dlouhou dobu. To umožňuje pochopit, zda v intrahostitelské evoluci dominují mutace poskytující selektivní výhodu (jako je odolnost vůči antibiotikům) nebo naopak neutrální mutace (nemají žádný vliv na produkované proteiny).

Populace Dvě fáze této studie budou provedeny u zdravých dospělých jedinců obou pohlaví. Zdraví dobrovolníci budou rekrutováni ze souboru zdravých dobrovolníků pro biomedicínský výzkum v Centru klinického vyšetřování (CIC) nemocniční skupiny Bichat - Claude Bernard.

Praktický postup Tento výzkum bude probíhat ve dvou po sobě jdoucích fázích: První tzv. pilotní fáze bude nejprve provedena se zdravými dobrovolníky. Během této pilotní fáze bude vybráno 50 zdravých dobrovolníků, kteří budou každé 2 týdny sledováni pro odběr vzorku stolice. Pilotní fáze bude zahrnovat 10 návštěv v celkové délce 18 týdnů na jednoho dobrovolníka. Kmeny izolované během této pilotní fáze budou sekvenovány, což umožní charakterizovat přítomné kmeny a možné změny kmenů mezi dvěma vzorky stolice. Míra nástupnictví bude odhadnuta. Výsledky této fáze identifikují optimální vzorkovací frekvenci, která maximalizuje přesnost při odhadu četnosti posloupnosti. To bude zachováno pro druhou fázi.

Účast dobrovolníků zařazených do pilotní studie bude rozdělena do 2 fází:

1. fáze výběru dobrovolníků v CIC: každý dobrovolník bude mít klinické vyšetření, aby se zajistila jeho způsobilost k účasti ve výzkumu. V den této návštěvy musí splnit všechna výběrová kritéria a podepsat souhlas s odběrem;
2. 18týdenní období sledování, během kterého dobrovolníci chodí do CIC ukládat vzorky stolice každé dva týdny po dobu 18 týdnů (což odpovídá 10 návštěvám).

Druhá fáze, prospektivní kohortová studie, bude také provedena u zdravých dobrovolníků. Během této druhé fáze budou moci zdraví dobrovolníci, kteří se zúčastnili první fáze, pokračovat ve své účasti a budou vybráni noví dobrovolníci. Zdraví dobrovolníci zahrnutí do prospektivní kohortové studie budou sledováni návštěvami a vzorky stolice, které budou definovány podle k výsledkům pilotní fáze po dobu maximálně 8 až 144 týdnů.

Účast dobrovolníků zahrnutých do kohortové studie bude rozdělena do 2 fází:

1. fáze pro výběr dobrovolníků v CIC (V1): všichni účastníci budou mít klinické vyšetření, aby byla zajištěna jejich způsobilost k účasti ve výzkumu. Musí splnit všechna kritéria pro zařazení dostupná v den této návštěvy a podepsat souhlas s odběrem.
2. doba sledování maximálně 144 týdnů: 8 kontrolních návštěv v rytmu 1 až 18 týdnů, tj. max. 8 až 144 týdnů. Dobrovolníci půjdou do CIC uložit vzorky stolice při každé z 8 plánovaných návštěv. Harmonogram těchto 8 návštěv bude stanoven na základě výsledků pilotní fáze.

Počet vybraných subjektů První fáze: 50 subjektů Druhá fáze: 200 subjektů, tj. 0 až 50 z pilotní fáze + 150 až 200 nových subjektů, v závislosti na počtu dobrovolníků v pilotní fázi, kteří chtějí pokračovat.

Počet center Monocentrická národní studie: Centrum klinického vyšetřování nemocniční skupiny Bichat - Claude Bernard.

Kalendář výzkumu

1. První fáze:

   • délka zařazení: 6 měsíců (26 týdnů)
   • délka účasti (léčba + sledování): 18 týdnů
   • celková doba trvání: 44 týdnů

2. Druhá fáze:

   • délka zařazení: 18 měsíců (78 týdnů)
   • délka účasti (léčba + sledování): 8 až 144 týdnů
   • celková doba trvání: 86 až 222 týdnů

Statistická analýza K odhadu míry přírůstku, ztráty a nahrazení kmenů E. coli v závislosti na hostiteli a bakteriálních faktorech budou provedeny statistické analýzy pomocí softwaru R v rámci Francouzského institutu pro zdraví a lékařský výzkum U722: nejprve na 50 dobrovolnících v pilotní fáze, která umožní první odhad těchto četností a definuje tak optimální plán odběru vzorků pro prospektivní kohortovou fázi, poté na 200 dobrovolnících této druhé fáze.

Statistický model použitý pro tyto dvě analýzy bude popisovat dynamiku kolonizace hostitele. Budeme předpokládat, že hostitelský kolonizační stav sleduje Markovův řetězec diskrétního stavu v nepřetržitém čase. Tento matematický model popisuje přechody mezi různými možnými stavy pomocí zesílení napětí, ztráty napětí a nahrazení kmene v hostiteli. Vypočítává pravděpodobnost získaných dat se znalostí parametrů (přírůstky deformace, ztráta deformace, nahrazení deformace) a tedy pravděpodobnost (pravděpodobnost, že data budou znát model). Z pravděpodobnosti lze parametry odhadnout metodami maximální věrohodnosti.

Kvantitativně budou parametry odhadnuty maximální pravděpodobností a přesnost bude kvantifikována pomocí intervalů spolehlivosti získaných metodou věrohodnostního profilu.

Bude také odhadnuta závislost míry zisku, ztráty a náhrady na několika hostitelských nebo bakteriálních proměnných. Význam vlivu proměnné na míru zisku, ztráty a náhrady bude testován porovnáním modelů: modely budou upraveny podle maximální pravděpodobnosti. Porovnání modelů bude provedeno testem věrohodnostního poměru.

Nejprve budou testovány faktory, které jsou a priori považovány za důležité pro přechodné míry. Úroveň významnosti těchto faktorů bude korigována pro více testů (Bonferroniho korekce). Ve druhém kroku bude explorativním způsobem analyzován dopad všech prvků genomu (celogenomová asociační studie).