Estudo da Dinâmica Ecológica e Evolutiva de Escherichia Coli na Flora Comensal Digestiva (EVE)

Escherichia Coli representa um importante problema de saúde pública. E. Coli não é apenas um comensal do trato digestivo, mas também um importante patógeno oportunista, primeira causa de infecções do trato urinário, primeira causa de bacteremia. No entanto, pouco se sabe sobre a dinâmica da colonização intestinal do hospedeiro humano. Compreender a dinâmica da colonização é crucial porque a seleção para as principais características de E. coli é a resistência a antibióticos e a virulência (a propensão a causar infecção) funciona no comensalismo, no intestino, não nas infecções. Este estudo possibilitará pela primeira vez estudar a dinâmica de colonização de E. coli em uma grande população hospedeira saudável. Em particular, quantificaremos como a perda ou ganho de certas cepas no intestino depende das propriedades do hospedeiro e das bactérias. Este estudo permitirá, assim, uma melhor compreensão da dinâmica epidemiológica da E. coli e do desenvolvimento de certas características, como a resistência a antibióticos.

Objetivo principal e critério O objetivo principal desta pesquisa é quantificar a sucessão (ganho, perda ou substituição) de cepas de E. coli na microbiota intestinal em voluntários saudáveis.

Objetivos e critérios secundários O objetivo secundário é estudar a evolução intra-hospedeiro de E. coli, focando na evolução de clones que colonizam o mesmo hospedeiro por longos períodos de tempo. Isto permite compreender se a evolução intra-hospedeiro é dominada por mutações que conferem uma vantagem selectiva (como a resistência aos antibióticos) ou, pelo contrário, por mutações neutras (que não afectam as proteínas produzidas).

População As duas fases deste estudo serão realizadas em adultos saudáveis ​​de ambos os sexos. Os voluntários sadios serão recrutados a partir do cadastro de voluntários sadios para pesquisa biomédica do Centro de Investigação Clínica (CIC) do grupo hospitalar Bichat - Claude Bernard.

Procedimento prático Esta pesquisa ocorrerá em duas fases sucessivas: Uma primeira chamada fase piloto será realizada primeiro com voluntários saudáveis. Durante esta fase piloto, 50 voluntários saudáveis ​​serão selecionados e acompanhados a cada 2 semanas para uma amostra de fezes. A fase piloto incluirá 10 visitas com duração total de 18 semanas por voluntário. As cepas isoladas nesta fase piloto serão sequenciadas, possibilitando caracterizar as cepas presentes e as possíveis alterações de cepas entre duas amostras de fezes. As taxas de sucessão serão estimadas. Os resultados desta fase identificam a taxa de amostragem ideal que maximiza a precisão na estimativa das taxas de sucessão. Isso será mantido para a segunda fase.

A participação dos voluntários incluídos no estudo piloto será dividida em 2 etapas:

1. uma etapa de seleção dos voluntários no CIC: cada voluntário passará por um exame clínico para garantir sua elegibilidade para participação na pesquisa. Ele deve atender a todos os critérios de seleção no dia desta visita e assinar o consentimento de coleta;
2. um período de acompanhamento de 18 semanas durante o qual os voluntários vão ao CIC para depositar amostras de fezes quinzenalmente durante 18 semanas (correspondente a 10 visitas).

Uma segunda fase, um estudo de coorte prospectivo também será realizado em voluntários saudáveis. Durante esta segunda fase, os voluntários saudáveis ​​que participaram da primeira fase poderão continuar sua participação e novos voluntários serão selecionados. Os voluntários saudáveis ​​incluídos no estudo de coorte prospectivo serão acompanhados com visitas e amostras de fezes que serão definidas de acordo aos resultados da fase piloto por um período máximo de 8 a 144 semanas.

A participação dos voluntários incluídos no estudo de coorte será dividida em 2 etapas:

1. uma etapa de seleção dos voluntários no CIC (V1): todos os participantes passarão por um exame clínico para garantir sua elegibilidade para participação na pesquisa. Eles devem atender a todos os critérios de inclusão disponíveis no dia desta visita e assinar o consentimento de coleta.
2. um período de acompanhamento de 144 semanas no máximo: 8 consultas de acompanhamento com um ritmo de 1 a 18 semanas, ou seja, 8 a 144 semanas no máximo. Os voluntários irão ao CIC para depositar amostras de fezes em cada uma das 8 visitas previstas. A programação dessas 8 visitas será determinada com base nos resultados da fase piloto.

Número de disciplinas selecionadas Primeira fase: 50 disciplinas Segunda fase: 200 disciplinas, ou seja, 0 a 50 da fase piloto + 150 a 200 novas disciplinas, dependendo do número de voluntários da fase piloto que desejam continuar.

Número de centros Estudo nacional monocêntrico: Centro de Investigação Clínica do grupo hospitalar Bichat - Claude Bernard.

calendário de pesquisa

1. Primeira fase:

   • duração da inclusão: 6 meses (26 semanas)
   • duração da participação (tratamento + acompanhamento): 18 semanas
   • duração total: 44 semanas

2. Segunda fase:

   • duração da inclusão: 18 meses (78 semanas)
   • duração da participação (tratamento + acompanhamento): 8 a 144 semanas
   • duração total: 86 a 222 semanas

Análise estatística Para estimar as taxas de ganho, perda e substituição de cepas de E. coli dependendo do hospedeiro e fatores bacterianos, análises estatísticas serão realizadas usando o software R dentro do Instituto Francês de Saúde e Pesquisa Médica U722: primeiro nos 50 voluntários no fase piloto, que permitirá uma primeira estimativa dessas taxas e definirá assim o cronograma de amostragem ótimo para a fase de coorte prospectiva, então nos 200 voluntários desta segunda fase.

O modelo estatístico utilizado para as duas análises descreverá a dinâmica da colonização do hospedeiro. Assumiremos que o estado de colonização do hospedeiro segue uma cadeia de Markov de estado discreto em tempo contínuo. Este modelo matemático descreve as transições entre os diferentes estados possíveis, por ganho de tensão, perda de tensão e substituição de tensão dentro do hospedeiro. Calcula a probabilidade dos dados obtidos conhecendo os parâmetros (ganhos de deformação, perda de deformação, substituição de deformação) e portanto a verossimilhança (a probabilidade de os dados conhecerem o modelo). A partir da verossimilhança, os parâmetros podem ser estimados por métodos de máxima verossimilhança.

Quantitativamente, os parâmetros serão estimados por máxima verossimilhança e a precisão será quantificada por intervalos de confiança obtidos pelo método do perfil de verossimilhança.

A dependência das taxas de ganho, perda e substituição de diversas variáveis ​​do hospedeiro ou da bactéria também será estimada. A significância do efeito de uma variável nas taxas de ganho, perda e substituição será testada por comparação de modelos: os modelos serão ajustados por máxima verossimilhança. A comparação dos modelos será feita pelo teste de razão de verossimilhança.

Primeiro, serão testados os fatores que a priori se suspeita serem importantes para as taxas de transição. O nível de significância desses fatores será corrigido para testes múltiplos (correção de Bonferroni). Em uma segunda etapa, o impacto de todos os elementos do genoma será analisado de forma exploratória (estudo de associação genômica ampla).