Untersuchung der ökologischen und evolutionären Dynamik von Escherichia Coli in der Darmflora (EVE)

Escherichia Coli stellt ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit dar. E. Coli ist nicht nur ein Kommensale des Verdauungstraktes, sondern auch ein wichtiger opportunistischer Erreger, Hauptursache von Harnwegsinfektionen, Hauptursache von Bakteriämie. Allerdings ist wenig über die Dynamik der Darmbesiedlung des menschlichen Wirts bekannt. Das Verständnis der Kolonisierungsdynamik ist von entscheidender Bedeutung, da die Selektion auf die Hauptmerkmale von E. coli die Antibiotikaresistenz ist und die Virulenz (die Neigung, Infektionen zu verursachen) im Kommensalismus, im Darm, nicht bei Infektionen wirkt. Diese Studie wird es erstmals ermöglichen, die Kolonisationsdynamik von E. coli in einer großen gesunden Wirtspopulation zu untersuchen. Insbesondere werden wir quantifizieren, wie der Verlust oder Gewinn bestimmter Stämme im Darm von den Eigenschaften des Wirts und der Bakterien abhängt. Diese Studie wird daher ein besseres Verständnis der epidemiologischen Dynamik von E. coli und der Entwicklung bestimmter Merkmale wie Antibiotikaresistenz liefern.

Hauptziel und Kriterium Das Hauptziel dieser Forschung ist die Quantifizierung der Nachfolge (Gewinn, Verlust oder Ersatz) von E. coli-Stämmen in der Darmmikrobiota bei gesunden Freiwilligen.

Sekundäre Ziele und Kriterien Das sekundäre Ziel besteht darin, die Evolution von E. coli innerhalb des Wirts zu untersuchen, indem man sich auf die Evolution von Klonen konzentriert, die denselben Wirt über lange Zeiträume besiedeln. Dies macht es möglich zu verstehen, ob die Evolution innerhalb des Wirts von Mutationen dominiert wird, die einen selektiven Vorteil verleihen (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) oder im Gegenteil von neutralen Mutationen (die keine Auswirkung auf die produzierten Proteine ​​haben).

Population Die zwei Phasen dieser Studie werden an gesunden Erwachsenen beiderlei Geschlechts durchgeführt. Gesunde Freiwillige werden aus der Liste gesunder Freiwilliger für die biomedizinische Forschung im Clinical Investigation Center (CIC) der Bichat-Claude Bernard-Krankenhausgruppe rekrutiert.

Praktisches Vorgehen Diese Forschung findet in zwei aufeinanderfolgenden Phasen statt: Eine erste sogenannte Pilotphase wird zunächst mit gesunden Probanden durchgeführt. Während dieser Pilotphase werden 50 gesunde Freiwillige ausgewählt und alle 2 Wochen für eine Stuhlprobe beobachtet. Die Pilotphase umfasst 10 Besuche für eine Gesamtdauer von 18 Wochen pro Freiwilligem. Die während dieser Pilotphase isolierten Stämme werden sequenziert, was es ermöglicht, die vorhandenen Stämme und die möglichen Stammveränderungen zwischen zwei Stuhlproben zu charakterisieren. Die Nachfolgeraten werden geschätzt. Die Ergebnisse dieser Phase identifizieren die optimale Abtastrate, die die Genauigkeit bei der Schätzung der Nachfolgeraten maximiert. Dies wird für die zweite Phase beibehalten.

Die Teilnahme der an der Pilotstudie beteiligten Freiwilligen wird in 2 Phasen unterteilt:

1. eine Phase der Freiwilligenauswahl am CIC: Jeder Freiwillige wird einer klinischen Untersuchung unterzogen, um sicherzustellen, dass er für die Teilnahme an der Forschung geeignet ist. Er muss am Tag dieses Besuchs alle Auswahlkriterien erfüllen und die Einzugsermächtigung unterschreiben;
2. eine 18-wöchige Nachbeobachtungsphase, in der die Freiwilligen 18 Wochen lang alle zwei Wochen (entsprechend 10 Besuchen) zum CIC gehen, um Stuhlproben abzugeben.

In einer zweiten Phase wird auch eine prospektive Kohortenstudie mit gesunden Probanden durchgeführt. Während dieser zweiten Phase können gesunde Freiwillige, die an der ersten Phase teilgenommen haben, ihre Teilnahme fortsetzen und neue Freiwillige werden ausgewählt an die Ergebnisse der Pilotphase für einen Zeitraum von 8 bis maximal 144 Wochen.

Die Teilnahme der in die Kohortenstudie eingeschlossenen Freiwilligen wird in 2 Phasen unterteilt:

1. eine Phase für die Auswahl von Freiwilligen am CIC (V1): Alle Teilnehmer werden einer klinischen Untersuchung unterzogen, um ihre Eignung zur Teilnahme an der Forschung sicherzustellen. Sie müssen alle am Tag dieses Besuchs verfügbaren Einschlusskriterien erfüllen und die Einwilligung zur Abholung unterzeichnen.
2. ein Nachsorgezeitraum von maximal 144 Wochen: 8 Nachsorgetermine im Rhythmus von 1 bis 18 Wochen, dh 8 bis 144 Wochen max. Die Freiwilligen gehen zum CIC, um bei jedem der 8 geplanten Besuche Stuhlproben abzugeben. Der Zeitplan für diese 8 Besuche wird auf der Grundlage der Ergebnisse der Pilotphase festgelegt.

Anzahl der ausgewählten Probanden Erste Phase: 50 Probanden Zweite Phase: 200 Probanden, dh 0 bis 50 aus der Pilotphase + 150 bis 200 neue Probanden, je nach Anzahl der Freiwilligen in der Pilotphase, die fortfahren möchten.

Anzahl der Zentren Monozentrische nationale Studie: Klinisches Untersuchungszentrum der Krankenhausgruppe Bichat - Claude Bernard.

Forschungskalender

1. Erste Phase:

   • Einschlussdauer: 6 Monate (26 Wochen)
   • Dauer der Teilnahme (Behandlung + Nachsorge): 18 Wochen
   • Gesamtdauer: 44 Wochen

2. Zweite Phase:

   • Einschlussdauer: 18 Monate (78 Wochen)
   • Dauer der Teilnahme (Behandlung + Nachsorge): 8 bis 144 Wochen
   • Gesamtdauer: 86 bis 222 Wochen

Statistische Analyse Um die Zuwachs-, Verlust- und Ersatzraten von E. coli-Stämmen in Abhängigkeit von Wirts- und Bakterienfaktoren abzuschätzen, werden statistische Analysen unter Verwendung der R-Software innerhalb des französischen Instituts für Gesundheit und medizinische Forschung U722 durchgeführt: zuerst an den 50 Freiwilligen im Pilotphase, die eine erste Schätzung dieser Raten ermöglicht und somit den optimalen Stichprobenplan für die voraussichtliche Kohortenphase definiert, dann an den 200 Freiwilligen dieser zweiten Phase.

Das für die beiden Analysen verwendete statistische Modell wird die Dynamik der Wirtsbesiedlung beschreiben. Wir nehmen an, dass der Wirtskolonisationszustand einer Markov-Kette mit diskreten Zuständen in kontinuierlicher Zeit folgt. Dieses mathematische Modell beschreibt die Übergänge zwischen den verschiedenen möglichen Zuständen durch Dehnungsgewinn, Dehnungsverlust und Dehnungsersatz innerhalb des Wirts. Es berechnet die Wahrscheinlichkeit der erhaltenen Daten bei Kenntnis der Parameter (Dehnungsgewinne, Dehnungsverluste, Dehnungsersatz) und damit die Wahrscheinlichkeit (die Wahrscheinlichkeit, dass die Daten das Modell kennen). Aus der Likelihood können die Parameter durch Maximum-Likelihood-Verfahren geschätzt werden.

Quantitativ werden die Parameter durch Maximum-Likelihood geschätzt und die Präzision wird durch Konfidenzintervalle quantifiziert, die durch die Likelihood-Profil-Methode erhalten werden.

Die Abhängigkeit der Gewinn-, Verlust- und Ersatzraten von mehreren Wirts- oder Bakterienvariablen wird ebenfalls abgeschätzt. Die Signifikanz der Auswirkung einer Variablen auf die Gewinn-, Verlust- und Ersatzquoten wird durch Modellvergleich getestet: Die Modelle werden um die maximale Wahrscheinlichkeit angepasst. Der Vergleich der Modelle wird durch Likelihood-Ratio-Tests durchgeführt.

Zunächst werden die Faktoren getestet, die a priori als wichtig für die Übergangsraten vermutet werden. Das Signifikanzniveau dieser Faktoren wird für multiple Tests korrigiert (Bonferroni-Korrektur). In einem zweiten Schritt wird der Einfluss aller Elemente des Genoms explorativ analysiert (genomweite Assoziationsstudie).