Studie av den økologiske og evolusjonære dynamikken til Escherichia coli i fordøyelseskanalens kommensalflora (EVE)

Escherichia Coli utgjør et stort folkehelseproblem. E. Coli er ikke bare en commensal av fordøyelseskanalen, men også et viktig opportunistisk patogen, første årsak til urinveisinfeksjoner, første årsak til bakteriemi. Imidlertid er lite kjent om dynamikken i intestinal kolonisering av den menneskelige verten. Å forstå dynamikken i kolonisering er avgjørende fordi seleksjon for de viktigste egenskapene til E. coli er antibiotikaresistens og virulens (tilbøyeligheten til å forårsake infeksjon) virker i kommensalisme, i tarmen, ikke i infeksjoner. Denne studien vil gjøre det mulig for første gang å studere koloniseringsdynamikken til E. coli i en stor sunn vertspopulasjon. Spesielt vil vi kvantifisere hvordan tapet eller gevinsten av visse stammer i tarmen avhenger av egenskapene til verten og bakteriene. Denne studien vil dermed gi en bedre forståelse av E. colis epidemiologiske dynamikk og utvikling av visse egenskaper som antibiotikaresistens.

Hovedmål og kriterium Hovedmålet med denne forskningen er å kvantifisere rekkefølgen (gevinst, tap eller erstatning) av E. coli-stammer i tarmmikrobiotaen hos friske frivillige.

Sekundære mål og kriterier Det sekundære målet er å studere intra-verts evolusjon av E. coli ved å fokusere på utviklingen av kloner som koloniserer den samme verten i lange perioder. Dette gjør det mulig å forstå om intravert-evolusjonen er dominert av mutasjoner som gir en selektiv fordel (som resistens mot antibiotika) eller tvert imot nøytrale mutasjoner (som ikke har noen effekt på proteinene som produseres).

Populasjon De to fasene av denne studien vil bli utført på friske voksne av begge kjønn. Friske frivillige vil bli rekruttert fra filen med friske frivillige for biomedisinsk forskning ved Clinical Investigation Center (CIC) til sykehusgruppen Bichat - Claude Bernard.

Praktisk prosedyre Denne forskningen vil foregå i to påfølgende faser: En første såkalt pilotfase vil først bli gjennomført med friske frivillige. I løpet av denne pilotfasen vil 50 friske frivillige bli valgt ut og fulgt hver 2. uke for en avføringsprøve. Pilotfasen vil omfatte 10 besøk med en total varighet på 18 uker per frivillig. Stammene som ble isolert i denne pilotfasen vil bli sekvensert, noe som gjør det mulig å karakterisere de tilstedeværende stammene og mulige endringer av stammer mellom to avføringsprøver. Etterfølgerater vil bli estimert. Resultatene av denne fasen identifiserer den optimale samplingsfrekvensen som maksimerer nøyaktigheten i å estimere suksesjonsrater. Denne beholdes i andre fase.

Deltakelsen til de frivillige som er inkludert i pilotstudien vil bli delt opp i 2 stadier:

1. et stadium av valg av frivillige ved CIC: hver frivillig vil ha en klinisk undersøkelse for å sikre at de er kvalifisert for deltakelse i forskningen. Han må oppfylle alle utvelgelseskriteriene på dagen for dette besøket og signere innsamlingssamtykket;
2. en 18-ukers oppfølgingsperiode hvor de frivillige går til CIC for å deponere avføringsprøver annenhver uke i 18 uker (tilsvarer 10 besøk).

En andre fase, en prospektiv kohortstudie vil også bli utført på friske frivillige. I løpet av denne andre fasen vil friske frivillige som deltok i første fase kunne fortsette sin deltakelse og nye frivillige vil bli valgt ut. De friske frivillige som inngår i den prospektive kohortstudien vil bli fulgt opp med besøk og avføringsprøver som vil bli definert iht. til resultatene av pilotfasen for en periode på maksimalt 8 til 144 uker.

Deltakelsen av frivillige inkludert i kohortstudien vil bli delt opp i 2 stadier:

1. et stadium for valg av frivillige ved CIC (V1): alle deltakere vil ha en klinisk undersøkelse for å sikre at de er kvalifisert for deltakelse i forskningen. De må oppfylle alle inklusjonskriteriene som er tilgjengelige på dagen for dette besøket og signere innsamlingssamtykket.
2. en oppfølgingstid på maks 144 uker: 8 oppfølgingsbesøk med en rytme på 1 til 18 uker, dvs. 8 til 144 uker maks. De frivillige vil gå til CIC for å deponere avføringsprøver ved hvert av de 8 planlagte besøkene. Tidsplanen for disse 8 besøkene vil bli fastsatt basert på resultatene fra pilotfasen.

Antall emner valgt Første fase: 50 emner Andre fase: 200 emner, dvs. 0 til 50 fra pilotfasen + 150 til 200 nye emner, avhengig av antall frivillige i pilotfasen som ønsker å fortsette.

Antall sentre Monosentrisk nasjonal studie: Clinical Investigation Center of the Bichat - Claude Bernard hospital group.

Forskningskalender

1. Første fase:

   • varighet av inkludering: 6 måneder (26 uker)
   • varighet av deltakelse (behandling + oppfølging): 18 uker
   • total varighet: 44 uker

2. Andre fase:

   • varighet av inkludering: 18 måneder (78 uker)
   • varighet av deltakelse (behandling + oppfølging): 8 til 144 uker
   • total varighet: 86 til 222 uker

Statistisk analyse For å estimere graden av gevinst, tap og erstatning av E. coli-stammer avhengig av verts- og bakteriefaktorer, vil statistiske analyser bli utført ved hjelp av R-programvare innen det franske instituttet for helse og medisinsk forskning U722: først på de 50 frivillige i pilotfasen, som vil tillate et første estimat av disse ratene og dermed definere den optimale prøvetakingsplanen for den potensielle kohortfasen, deretter på de 200 frivillige i denne andre fasen.

Den statistiske modellen brukt for de to analysene vil beskrive dynamikken i vertskolonisering. Vi vil anta at vertskoloniseringsstaten følger en diskret-stats Markov-kjede i kontinuerlig tid. Denne matematiske modellen beskriver overgangene mellom de forskjellige mulige tilstandene, ved belastningsforsterkning, belastningstap og belastningserstatning i verten. Den beregner sannsynligheten for at dataene oppnås ved å kjenne parametrene (strain gains, strain tap, strain replacement) og dermed sannsynligheten (sannsynligheten for at dataene kjenner modellen). Fra sannsynligheten kan parametrene estimeres ved maksimal sannsynlighetsmetoder.

Kvantitativt vil parametrene bli estimert ved maksimal sannsynlighet og presisjonen vil kvantifiseres ved hjelp av konfidensintervaller oppnådd med sannsynlighetsprofilmetoden.

Avhengigheten av gevinst, tap og erstatningsrater på flere verts- eller bakterievariabler vil også bli estimert. Betydningen av effekten av en variabel på gevinst, tap og erstatningsrater vil bli testet ved modellsammenligning: modellene vil bli justert etter maksimal sannsynlighet. Sammenligningen av modeller vil bli gjort ved hjelp av likelihood ratio test.

Først vil de faktorer som på forhånd mistenkes å ha betydning for overgangsrater, testes. Signifikansnivået til disse faktorene vil bli korrigert for flere tester (Bonferroni-korreksjon). I et andre trinn vil virkningen av alle elementene i genomet bli analysert på en utforskende måte (genomomfattende assosiasjonsstudie).