Badanie dynamiki ekologicznej i ewolucyjnej Escherichia coli w trawiennej florze komensalnej (EVE)

Escherichia Coli stanowi poważny problem zdrowia publicznego. E. coli jest nie tylko komensalem przewodu pokarmowego, ale także głównym patogenem oportunistycznym, pierwszą przyczyną infekcji dróg moczowych, pierwszą przyczyną bakteriemii. Jednak niewiele wiadomo na temat dynamiki kolonizacji jelit gospodarza ludzkiego. Zrozumienie dynamiki kolonizacji ma kluczowe znaczenie, ponieważ selekcja pod kątem głównych cech E. coli to oporność na antybiotyki, a wirulencja (skłonność do wywoływania infekcji) działa w komensalizmie, w jelitach, a nie w infekcjach. Badanie to umożliwi po raz pierwszy zbadanie dynamiki kolonizacji E. coli w dużej populacji zdrowych żywicieli. W szczególności określimy ilościowo, w jaki sposób utrata lub wzrost niektórych szczepów w jelicie zależy od właściwości gospodarza i bakterii. Badanie to zapewni zatem lepsze zrozumienie dynamiki epidemiologicznej E. coli i rozwoju pewnych cech, takich jak oporność na antybiotyki.

Główny cel i kryterium Głównym celem tego badania jest ilościowe określenie następstwa (wzrostu, utraty lub zastąpienia) szczepów E. coli w mikroflorze jelitowej zdrowych ochotników.

Cele i kryteria drugorzędne Celem drugorzędnym jest zbadanie ewolucji E. coli wewnątrz żywiciela poprzez skupienie się na ewolucji klonów kolonizujących tego samego żywiciela przez długi czas. Pozwala to zrozumieć, czy ewolucja wewnątrz żywiciela jest zdominowana przez mutacje nadające selektywną przewagę (takie jak oporność na antybiotyki), czy wręcz przeciwnie, mutacje neutralne (nie mające wpływu na wytwarzane białka).

Populacja Dwie fazy tego badania zostaną przeprowadzone na zdrowych osobach dorosłych obojga płci. Zdrowi ochotnicy będą rekrutowani z akt zdrowych ochotników do badań biomedycznych w Centrum Badań Klinicznych (CIC) grupy szpitalnej Bichat - Claude Bernard.

Procedura praktyczna Badania będą przebiegać w dwóch następujących po sobie fazach: Pierwsza tak zwana faza pilotażowa zostanie przeprowadzona na zdrowych ochotnikach. Podczas tej fazy pilotażowej zostanie wybranych 50 zdrowych ochotników, którzy będą obserwowani co 2 tygodnie w celu pobrania próbki kału. Faza pilotażowa obejmie 10 wizyt o łącznym czasie trwania 18 tygodni na wolontariusza. Szczepy wyizolowane podczas tej fazy pilotażowej zostaną zsekwencjonowane, co umożliwi scharakteryzowanie obecnych szczepów i możliwych zmian szczepów między dwiema próbkami kału. Wskaźniki spadkowe zostaną oszacowane. Wyniki tej fazy identyfikują optymalną częstotliwość próbkowania, która maksymalizuje dokładność szacowania wskaźników sukcesji. Zostanie to zachowane w drugiej fazie.

Udział wolontariuszy objętych badaniem pilotażowym zostanie podzielony na 2 etapy:

1. etap selekcji ochotników w CIC: każdy ochotnik zostanie poddany badaniu klinicznemu w celu sprawdzenia, czy kwalifikuje się do udziału w badaniu. Musi spełnić wszystkie kryteria selekcji w dniu tej wizyty i podpisać zgodę na odbiór;
2. 18-tygodniowy okres obserwacji, podczas którego ochotnicy udają się do CIC w celu zdeponowania próbek kału co dwa tygodnie przez 18 tygodni (co odpowiada 10 wizytom).

Druga faza, prospektywne badanie kohortowe, zostanie również przeprowadzona na zdrowych ochotnikach. Podczas tej drugiej fazy zdrowi ochotnicy, którzy uczestniczyli w pierwszej fazie, będą mogli kontynuować swój udział i zostaną wybrani nowi ochotnicy. Zdrowi ochotnicy włączeni do prospektywnego badania kohortowego zostaną poddani wizytom i pobraniu próbek kału, które zostaną określone zgodnie z do wyników fazy pilotażowej przez okres od 8 do maksymalnie 144 tygodni.

Udział ochotników objętych badaniem kohortowym zostanie podzielony na 2 etapy:

1. etap selekcji ochotników w CIC (V1): wszyscy uczestnicy zostaną poddani badaniu klinicznemu, które zakwalifikuje ich do udziału w badaniu. Muszą spełniać wszystkie kryteria włączenia dostępne w dniu tej wizyty i podpisać zgodę na zbiórkę.
2. okres kontrolny maksymalnie 144 tygodnie: 8 wizyt kontrolnych w rytmie od 1 do 18 tygodni, czyli od 8 do 144 tygodni max. Wolontariusze będą udawać się do CIC w celu zdeponowania próbek kału na każdej z 8 zaplanowanych wizyt. Harmonogram tych 8 wizyt zostanie ustalony na podstawie wyników fazy pilotażowej.

Liczba wybranych przedmiotów Pierwsza faza: 50 osób Druga faza: 200 osób, tj. od 0 do 50 z fazy pilotażowej + 150 do 200 nowych osób, w zależności od liczby ochotników w fazie pilotażowej, którzy chcą kontynuować.

Liczba ośrodków Monocentryczne badanie krajowe: Centrum Badań Klinicznych grupy szpitalnej Bichat - Claude Bernard.

Kalendarz badań

1. Pierwsza faza:

   • czas trwania włączenia: 6 miesięcy (26 tygodni)
   • czas trwania uczestnictwa (leczenie + obserwacja): 18 tygodni
   • całkowity czas trwania: 44 tygodnie

2. Druga faza:

   • czas trwania włączenia: 18 miesięcy (78 tygodni)
   • czas trwania uczestnictwa (leczenie + obserwacja): od 8 do 144 tygodni
   • całkowity czas trwania: od 86 do 222 tygodni

Analiza statystyczna Aby oszacować współczynniki przyrostu, utraty i wymiany szczepów E. coli w zależności od gospodarza i czynników bakteryjnych, zostaną przeprowadzone analizy statystyczne przy użyciu oprogramowania R we Francuskim Instytucie Zdrowia i Badań Medycznych U722: najpierw na 50 ochotnikach w fazie pilotażowej, która pozwoli na pierwsze oszacowanie tych współczynników i określenie w ten sposób optymalnego harmonogramu pobierania próbek dla prospektywnej fazy kohortowej, a następnie na 200 ochotnikach tej drugiej fazy.

Model statystyczny zastosowany w obu analizach będzie opisywał dynamikę kolonizacji żywiciela. Założymy, że stan kolonizacji gospodarza jest zgodny z łańcuchem Markowa o stanie dyskretnym w czasie ciągłym. Ten model matematyczny opisuje przejścia między różnymi możliwymi stanami, poprzez wzmocnienie odkształcenia, utratę odkształcenia i wymianę odkształcenia w gospodarzu. Oblicza prawdopodobieństwo uzyskania danych znając parametry (wzmocnienia odkształcenia, straty odkształcenia, zastąpienie odkształcenia), a zatem prawdopodobieństwo (prawdopodobieństwo znajomości modelu). Na podstawie prawdopodobieństwa parametry można oszacować metodami największej wiarygodności.

Ilościowo parametry zostaną oszacowane na podstawie maksymalnego prawdopodobieństwa, a precyzja zostanie określona ilościowo na podstawie przedziałów ufności uzyskanych metodą profilu wiarygodności.

Oszacowana zostanie również zależność współczynników zysku, utraty i wymiany od kilku zmiennych żywiciela lub bakterii. Znaczenie wpływu zmiennej na stopy zysku, straty i wymiany zostanie przetestowane przez porównanie modeli: modele zostaną skorygowane o maksymalne prawdopodobieństwo. Porównanie modeli zostanie przeprowadzone za pomocą testu ilorazu wiarygodności.

Po pierwsze, przetestowane zostaną czynniki, co do których a priori podejrzewa się, że są istotne dla tempa zmian. Poziom istotności tych czynników zostanie skorygowany dla wielu testów (poprawka Bonferroniego). W drugim etapie wpływ wszystkich elementów genomu zostanie przeanalizowany w sposób eksploracyjny (badanie asocjacyjne całego genomu).