Estudio de la Dinámica Ecológica y Evolutiva de Escherichia Coli en la Flora Comensal Digestiva (EVE)

Escherichia Coli plantea un importante problema de salud pública. E. Coli no solo es un comensal del tracto digestivo sino también un importante patógeno oportunista, primera causa de infecciones del tracto urinario, primera causa de bacteriemia. Sin embargo, poco se sabe sobre la dinámica de la colonización intestinal del huésped humano. Comprender la dinámica de la colonización es crucial porque la selección de las principales características de E. coli es la resistencia a los antibióticos y la virulencia (la propensión a causar infección) funciona en el comensalismo, en el intestino, no en las infecciones. Este estudio permitirá por primera vez estudiar la dinámica de colonización de E. coli en una gran población de huéspedes sanos. En particular, cuantificaremos cómo la pérdida o ganancia de ciertas cepas en el intestino depende de las propiedades del huésped y de la bacteria. Por lo tanto, este estudio proporcionará una mejor comprensión de la dinámica epidemiológica de E. coli y el desarrollo de ciertos rasgos, como la resistencia a los antibióticos.

Objetivo principal y criterio El objetivo principal de esta investigación es cuantificar la sucesión (ganancia, pérdida o reemplazo) de cepas de E. coli en la microbiota intestinal en voluntarios sanos.

Objetivos y criterios secundarios El objetivo secundario es estudiar la evolución intrahuésped de E. coli centrándose en la evolución de clones que colonizan el mismo huésped durante largos periodos de tiempo. Esto permite comprender si la evolución intrahuésped está dominada por mutaciones que confieren una ventaja selectiva (como la resistencia a los antibióticos) o por el contrario mutaciones neutras (sin efecto sobre las proteínas producidas).

Población Las dos fases de este estudio se realizarán en adultos sanos de ambos sexos. Los voluntarios sanos serán reclutados del archivo de voluntarios sanos para investigación biomédica en el Centro de Investigación Clínica (CIC) del grupo hospitalario Bichat - Claude Bernard.

Procedimiento práctico Esta investigación se llevará a cabo en dos fases sucesivas: Una primera fase denominada piloto se llevará a cabo primero con voluntarios sanos. Durante esta fase piloto, 50 voluntarios sanos serán seleccionados y seguidos cada 2 semanas para una muestra de heces. La fase piloto incluirá 10 visitas con una duración total de 18 semanas por voluntario. Las cepas aisladas durante esta fase piloto serán secuenciadas, lo que permitirá caracterizar las cepas presentes y los posibles cambios de cepas entre dos muestras de heces. Se estimarán las tasas de sucesión. Los resultados de esta fase identifican la tasa de muestreo óptima que maximiza la precisión en la estimación de las tasas de sucesión. Esto se mantendrá para la segunda fase.

La participación de los voluntarios incluidos en el estudio piloto se dividirá en 2 etapas:

1. una etapa de selección de voluntarios en el CIC: cada voluntario tendrá un examen clínico para asegurar su elegibilidad para participar en la investigación. Debe cumplir con todos los criterios de selección el día de esta visita y firmar el consentimiento de recolección;
2. un período de seguimiento de 18 semanas durante el cual los voluntarios acuden al CIC a depositar muestras de heces cada dos semanas durante 18 semanas (correspondientes a 10 visitas).

También se llevará a cabo una segunda fase, un estudio de cohorte prospectivo en voluntarios sanos. Durante esta segunda fase, los voluntarios sanos que participaron en la primera fase podrán continuar con su participación y se seleccionarán nuevos voluntarios. A los voluntarios sanos incluidos en el estudio de cohorte prospectivo se les hará un seguimiento con visitas y muestras de heces que se definirán según a los resultados de la fase piloto por un período de 8 a 144 semanas como máximo.

La participación de los voluntarios incluidos en el estudio de cohortes se dividirá en 2 etapas:

1. una etapa de selección de voluntarios en el CIC (V1): todos los participantes tendrán un examen clínico para asegurar su elegibilidad para participar en la investigación. Deben cumplir con todos los criterios de inclusión disponibles el día de esta visita y firmar el consentimiento de recolección.
2. un período de seguimiento de 144 semanas como máximo: 8 visitas de seguimiento con un ritmo de 1 a 18 semanas, es decir, de 8 a 144 semanas como máximo. Los voluntarios acudirán al CIC a depositar muestras de heces en cada una de las 8 visitas previstas. El calendario de estas 8 visitas se determinará en función de los resultados de la fase piloto.

Número de sujetos seleccionados Primera fase: 50 sujetos Segunda fase: 200 sujetos, es decir 0 a 50 de la fase piloto + 150 a 200 sujetos nuevos, dependiendo del número de voluntarios en fase piloto que deseen continuar.

Número de centros Estudio nacional monocéntrico: Centro de Investigación Clínica del grupo hospitalario Bichat - Claude Bernard.

Calendario de investigación

1. Primera fase:

   • duración de la inclusión: 6 meses (26 semanas)
   • duración de la participación (tratamiento + seguimiento): 18 semanas
   • duración total: 44 semanas

2. Segunda fase:

   • duración de la inclusión: 18 meses (78 semanas)
   • duración de la participación (tratamiento + seguimiento): 8 a 144 semanas
   • duración total: 86 a 222 semanas

Análisis estadístico Para estimar las tasas de ganancia, pérdida y reemplazo de las cepas de E. coli según el huésped y los factores bacterianos, se realizarán análisis estadísticos usando el software R dentro del Instituto Francés de Investigación Médica y de Salud U722: primero en los 50 voluntarios en el fase piloto, que permitirá una primera estimación de estas tasas y definir así el programa de muestreo óptimo para la fase de cohorte prospectiva, luego sobre los 200 voluntarios de esta segunda fase.

El modelo estadístico utilizado para los dos análisis describirá la dinámica de la colonización del huésped. Supondremos que el estado de colonización del huésped sigue una cadena de Markov de estado discreto en tiempo continuo. Este modelo matemático describe las transiciones entre los diferentes estados posibles, por ganancia de tensión, pérdida de tensión y reemplazo de tensión dentro del huésped. Calcula la probabilidad de que los datos obtenidos conozcan los parámetros (ganancias de deformación, pérdida de deformación, reemplazo de deformación) y por tanto la probabilidad (la probabilidad de que los datos conozcan el modelo). A partir de la verosimilitud, los parámetros pueden ser estimados por métodos de máxima verosimilitud.

Cuantitativamente, los parámetros se estimarán por máxima verosimilitud y la precisión se cuantificará por intervalos de confianza obtenidos por el método del perfil de verosimilitud.

También se estimará la dependencia de las tasas de ganancia, pérdida y reemplazo de varias variables del huésped o bacterianas. La importancia del efecto de una variable sobre las tasas de ganancia, pérdida y reemplazo se probará mediante comparación de modelos: los modelos se ajustarán por máxima verosimilitud. La comparación de modelos se realizará mediante la prueba de razón de verosimilitud.

Primero, se probarán los factores que se sospecha a priori que son importantes para las tasas de transición. El nivel de significación de estos factores se corregirá para múltiples pruebas (corrección de Bonferroni). En un segundo paso, se analizará el impacto de todos los elementos del genoma de forma exploratoria (estudio de asociación del genoma completo).