Studie av den ekologiska och evolutionära dynamiken hos Escherichia coli i matsmältningskanalens kommensalflora (EVE)

Escherichia Coli utgör ett stort folkhälsoproblem. E. Coli är inte bara en commensal av matsmältningskanalen utan också en viktig opportunistisk patogen, första orsaken till urinvägsinfektioner, första orsaken till bakteriemi. Men lite är känt om dynamiken i tarmkolonisering av den mänskliga värden. Att förstå koloniseringens dynamik är avgörande eftersom urval för de viktigaste egenskaperna hos E. coli är antibiotikaresistens och virulens (benägenheten att orsaka infektion) fungerar i kommensalism, i tarmen, inte vid infektioner. Denna studie kommer att göra det möjligt för första gången att studera kolonisationsdynamiken hos E. coli i en stor frisk värdpopulation. I synnerhet kommer vi att kvantifiera hur förlusten eller vinsten av vissa stammar i tarmen beror på egenskaperna hos värden och bakterierna. Denna studie kommer således att ge en bättre förståelse av E. colis epidemiologiska dynamik och utvecklingen av vissa egenskaper såsom antibiotikaresistens.

Huvudmål och kriterium Huvudsyftet med denna forskning är att kvantifiera successionen (vinst, förlust eller ersättning) av E. coli-stammar i tarmmikrobiotan hos friska frivilliga.

Sekundära mål och kriterier Det sekundära målet är att studera intra-värdutvecklingen av E. coli genom att fokusera på utvecklingen av kloner som koloniserar samma värd under långa tidsperioder. Detta gör det möjligt att förstå huruvida intravärdevolutionen domineras av mutationer som ger en selektiv fördel (såsom resistens mot antibiotika) eller tvärtom neutrala mutationer (som inte har någon effekt på de producerade proteinerna).

Population De två faserna av denna studie kommer att genomföras på friska vuxna av båda könen. Friska frivilliga kommer att rekryteras från filen med friska frivilliga för biomedicinsk forskning vid Clinical Investigation Center (CIC) i sjukhusgruppen Bichat - Claude Bernard.

Praktisk procedur Denna forskning kommer att ske i två på varandra följande faser: En första så kallad pilotfas kommer först att genomföras med friska frivilliga. Under denna pilotfas kommer 50 friska frivilliga att väljas ut och följas varannan vecka för ett avföringsprov. Pilotfasen kommer att omfatta 10 besök under en total varaktighet av 18 veckor per volontär. Stammarna som isolerats under denna pilotfas kommer att sekvenseras, vilket gör det möjligt att karakterisera de stammar som finns och eventuella förändringar av stammar mellan två avföringsprover. Successionstal kommer att uppskattas. Resultaten av denna fas identifierar den optimala samplingsfrekvensen som maximerar noggrannheten vid uppskattning av successionsfrekvenser. Detta kommer att behållas för den andra fasen.

Deltagandet av de volontärer som ingår i pilotstudien kommer att delas upp i två steg:

1. ett skede av volontärers urval vid CIC: varje volontär kommer att genomgå en klinisk undersökning för att säkerställa att de är berättigade till deltagande i forskningen. Han måste uppfylla alla urvalskriterier på dagen för detta besök och underteckna insamlingstillståndet;
2. en 18-veckors uppföljningsperiod under vilken volontärerna går till CIC för att deponera avföringsprover varannan vecka i 18 veckor (motsvarande 10 besök).

En andra fas, en prospektiv kohortstudie kommer också att genomföras på friska frivilliga. Under denna andra fas kommer friska frivilliga som deltog i den första fasen att kunna fortsätta sitt deltagande och nya frivilliga kommer att väljas ut. De friska frivilliga som ingår i den prospektiva kohortstudien kommer att följas upp med besök och avföringsprover som kommer att definieras enligt till resultaten av pilotfasen under en period av högst 8 till 144 veckor.

Deltagandet av volontärer som ingår i kohortstudien kommer att delas upp i två steg:

1. ett steg för urvalet av frivilliga vid CIC (V1): alla deltagare kommer att genomgå en klinisk undersökning för att säkerställa att de är berättigade till deltagande i forskningen. De måste uppfylla alla inklusionskriterier som finns tillgängliga på dagen för detta besök och underteckna insamlingstillståndet.
2. en uppföljningstid på max 144 veckor: 8 uppföljningsbesök med en rytm på 1 till 18 veckor, dvs max 8 till 144 veckor. Volontärerna kommer att gå till CIC för att deponera avföringsprover vid vart och ett av de 8 planerade besöken. Tidsplanen för dessa 8 besök kommer att fastställas baserat på resultaten av pilotfasen.

Antal valda ämnen Första fasen: 50 ämnen Andra fasen: 200 ämnen, dvs 0 till 50 från pilotfasen + 150 till 200 nya ämnen, beroende på antalet frivilliga i pilotfasen som vill fortsätta.

Antal centra Monocentrisk nationell studie: Clinical Investigation Center av sjukhusgruppen Bichat - Claude Bernard.

Forskningskalender

1. Första fasen:

   • varaktighet för inkluderingen: 6 månader (26 veckor)
   • varaktighet för deltagande (behandling + uppföljning): 18 veckor
   • total varaktighet: 44 veckor

2. Andra fasen:

   • varaktighet för inkluderingen: 18 månader (78 veckor)
   • varaktighet för deltagande (behandling + uppföljning): 8 till 144 veckor
   • total varaktighet: 86 till 222 veckor

Statistisk analys För att uppskatta graden av vinst, förlust och ersättning av E. coli-stammar beroende på värd- och bakteriefaktorer, kommer statistiska analyser att utföras med R-programvara inom det franska institutet för hälso- och medicinsk forskning U722: först på de 50 frivilliga i pilotfasen, som kommer att möjliggöra en första uppskattning av dessa frekvenser och därmed definiera det optimala provtagningsschemat för den blivande kohortfasen, sedan på de 200 frivilliga i denna andra fas.

Den statistiska modellen som används för de två analyserna kommer att beskriva dynamiken i värdkolonisering. Vi kommer att anta att värdkoloniseringsstaten följer en diskret Markov-kedja i kontinuerlig tid. Denna matematiska modell beskriver övergångarna mellan de olika möjliga tillstånden, genom töjningsförstärkning, töjningsförlust och stambyte inom värden. Den beräknar sannolikheten för att de erhållna uppgifterna känner till parametrarna (töjningsvinster, töjningsförluster, töjningsersättning) och därför sannolikheten (sannolikheten för att data känner till modellen). Från sannolikheten kan parametrarna uppskattas med maximal sannolikhetsmetoder.

Kvantitativt kommer parametrarna att uppskattas av maximal sannolikhet och precisionen kommer att kvantifieras genom konfidensintervall erhållna med sannolikhetsprofilmetoden.

Beroendet av vinst, förlust och ersättningshastigheter på flera värd- eller bakterievariabler kommer också att uppskattas. Betydelsen av effekten av en variabel på vinst-, förlust- och ersättningsgraden kommer att testas genom modelljämförelse: modellerna kommer att justeras efter maximal sannolikhet. Jämförelsen av modeller kommer att göras genom sannolikhetsförhållandetest.

Först kommer de faktorer som på förhand misstänks vara viktiga för övergångstakten att testas. Signifikansnivån för dessa faktorer kommer att korrigeras för flera tester (Bonferroni-korrigering). I ett andra steg kommer effekten av alla delar av genomet att analyseras på ett utforskande sätt (genomomfattande associationsstudie).