Studie van de ecologische en evolutionaire dynamiek van Escherichia coli in de spijsverteringscommensale flora (EVE)

Escherichia Coli vormt een groot probleem voor de volksgezondheid. E. Coli is niet alleen een commensaal van het spijsverteringskanaal, maar ook een belangrijke opportunistische ziekteverwekker, de eerste oorzaak van urineweginfecties, de eerste oorzaak van bacteriëmie. Er is echter weinig bekend over de dynamiek van darmkolonisatie van de menselijke gastheer. Het begrijpen van de dynamiek van kolonisatie is cruciaal, omdat selectie voor de belangrijkste eigenschappen van E. coli antibioticaresistentie en virulentie (de neiging om infectie te veroorzaken) werkt bij commensalisme, in de darm, niet bij infecties. Deze studie zal het voor het eerst mogelijk maken om de kolonisatiedynamiek van E. coli in een grote gezonde gastheerpopulatie te bestuderen. In het bijzonder zullen we kwantificeren hoe het verlies of de winst van bepaalde stammen in de darm afhangt van de eigenschappen van de gastheer en de bacterie. Deze studie zal dus een beter inzicht geven in de epidemiologische dynamiek van E. coli en de ontwikkeling van bepaalde eigenschappen zoals antibioticaresistentie.

Hoofddoel en criterium Het hoofddoel van dit onderzoek is het kwantificeren van de successie (winst, verlies of vervanging) van E. coli-stammen in de darmmicrobiota bij gezonde vrijwilligers.

Secundaire doelstellingen en criteria De secundaire doelstelling is het bestuderen van de intra-gastheer evolutie van E. coli door te focussen op de evolutie van klonen die gedurende lange tijd dezelfde gastheer koloniseren. Dit maakt het mogelijk om te begrijpen of de evolutie binnen de gastheer wordt gedomineerd door mutaties die een selectief voordeel opleveren (zoals resistentie tegen antibiotica) of juist door neutrale mutaties (die geen effect hebben op de geproduceerde eiwitten).

Populatie De twee fasen van deze studie zullen worden uitgevoerd bij gezonde volwassenen van beide geslachten. Gezonde vrijwilligers zullen worden geworven uit het bestand van gezonde vrijwilligers voor biomedisch onderzoek in het Clinical Investigation Centre (CIC) van de ziekenhuisgroep Bichat - Claude Bernard.

Praktijkverloop Dit onderzoek zal in twee opeenvolgende fasen verlopen: Eerst wordt een eerste zogenaamde pilotfase uitgevoerd met gezonde vrijwilligers. Tijdens deze pilootfase worden 50 gezonde vrijwilligers geselecteerd en elke 2 weken gevolgd voor een ontlastingsstaal. De proeffase omvat 10 bezoeken voor een totale duur van 18 weken per vrijwilliger. De stammen die tijdens deze pilootfase zijn geïsoleerd, zullen worden gesequenced, wat het mogelijk zal maken om de aanwezige stammen en de mogelijke veranderingen van stammen tussen twee ontlastingsmonsters te karakteriseren. Opvolgingspercentages worden geschat. De resultaten van deze fase identificeren de optimale bemonsteringsfrequentie die de nauwkeurigheid maximaliseert bij het schatten van successiepercentages. Deze blijft behouden voor de tweede fase.

De deelname van de vrijwilligers die deelnemen aan de pilootstudie wordt opgesplitst in 2 fasen:

1. een fase van de selectie van vrijwilligers bij het CIC: elke vrijwilliger zal een klinisch onderzoek ondergaan om te verzekeren dat hij of zij in aanmerking komt voor deelname aan het onderzoek. Hij moet op de dag van dit bezoek aan alle selectiecriteria voldoen en de afnametoestemming ondertekenen;
2. een follow-upperiode van 18 weken waarin de vrijwilligers 18 weken lang om de twee weken (overeenkomend met 10 bezoeken) naar het CIC gaan om ontlastingsmonsters af te geven.

In een tweede fase zal ook een prospectieve cohortstudie worden uitgevoerd bij gezonde vrijwilligers. Tijdens deze tweede fase kunnen gezonde vrijwilligers die deelnamen aan de eerste fase hun deelname voortzetten en zullen nieuwe vrijwilligers worden geselecteerd. op de resultaten van de pilotfase voor een periode van 8 tot maximaal 144 weken.

De deelname van vrijwilligers aan de cohortstudie wordt opgesplitst in 2 fasen:

1. een fase voor de selectie van vrijwilligers bij het CIC (V1): alle deelnemers ondergaan een klinisch onderzoek om te controleren of ze in aanmerking komen voor deelname aan het onderzoek. Ze moeten voldoen aan alle inclusiecriteria die beschikbaar zijn op de dag van dit bezoek en de toestemming voor het verzamelen ondertekenen.
2. een nacontroleperiode van maximaal 144 weken: 8 nacontroles met een ritme van 1 tot 18 weken, dus 8 tot maximaal 144 weken. De vrijwilligers gaan naar het CIC om ontlastingsmonsters te deponeren bij elk van de 8 geplande bezoeken. De planning voor deze 8 bezoeken wordt bepaald op basis van de resultaten van de pilootfase.

Aantal geselecteerde proefpersonen Eerste fase: 50 proefpersonen Tweede fase: 200 proefpersonen, dus 0 tot 50 uit de pilotfase + 150 tot 200 nieuwe proefpersonen, afhankelijk van het aantal vrijwilligers in de pilotfase dat verder wil.

Aantal centra Monocentrische nationale studie: Centrum voor klinisch onderzoek van de ziekenhuisgroep Bichat - Claude Bernard.

Onderzoek kalender

1. Eerste fase:

   • duur van opname: 6 maanden (26 weken)
   • deelnameduur (behandeling + nacontrole): 18 weken
   • totale duur: 44 weken

2. Tweede fase:

   • opnameduur: 18 maanden (78 weken)
   • deelnameduur (behandeling + nacontrole): 8 tot 144 weken
   • totale duur: 86 tot 222 weken

Statistische analyse Om de snelheid van winst, verlies en vervanging van E. coli-stammen te schatten, afhankelijk van gastheer- en bacteriële factoren, zullen statistische analyses worden uitgevoerd met behulp van R-software binnen het Franse Instituut voor Gezondheid en Medisch Onderzoek U722: eerst op de 50 vrijwilligers in de pilootfase, die een eerste schatting van deze percentages mogelijk zal maken en zo het optimale bemonsteringsschema voor de toekomstige cohortfase zal definiëren, en vervolgens op de 200 vrijwilligers van deze tweede fase.

Het statistische model dat voor de twee analyses wordt gebruikt, zal de dynamiek van gastheerkolonisatie beschrijven. We gaan ervan uit dat de gastkolonisatiestaat een discrete-state Markov-keten volgt in continue tijd. Dit wiskundige model beschrijft de overgangen tussen de verschillende mogelijke toestanden, door spanningstoename, spanningsverlies en spanningsvervanging binnen de gastheer. Het berekent de waarschijnlijkheid van de verkregen gegevens met kennis van de parameters (spanningstoename, spanningsverlies, spanningsvervanging) en dus de waarschijnlijkheid (de waarschijnlijkheid dat de gegevens het model kennen). Uit de waarschijnlijkheid kunnen de parameters worden geschat met behulp van methoden met maximale waarschijnlijkheid.

Kwantitatief zullen de parameters worden geschat op basis van maximale waarschijnlijkheid en de precisie zal worden gekwantificeerd door middel van betrouwbaarheidsintervallen verkregen door de waarschijnlijkheidsprofielmethode.

De afhankelijkheid van de winst-, verlies- en vervangingspercentages van verschillende gastheer- of bacteriële variabelen zal ook worden geschat. De significantie van het effect van een variabele op de winst-, verlies- en vervangingsratio's wordt getoetst door modelvergelijking: de modellen worden aangepast op maximale waarschijnlijkheid. De vergelijking van modellen zal worden gedaan door de waarschijnlijkheidsratiotest.

Eerst worden de factoren getoetst waarvan a priori wordt vermoed dat ze van belang zijn voor de overgangspercentages. Het significantieniveau van deze factoren wordt voor meerdere tests gecorrigeerd (Bonferroni-correctie). In een tweede stap wordt de impact van alle elementen van het genoom verkennend geanalyseerd (genoombrede associatiestudie).