Изучение эколого-эволюционной динамики Escherichia Coli в пищеварительной комменсальной флоре (EVE)

Escherichia Coli представляет серьезную проблему для общественного здравоохранения. E. Coli является не только комменсалом пищеварительного тракта, но и основным условно-патогенным микроорганизмом, первопричиной инфекций мочевыводящих путей, первопричиной бактериемии. Однако мало что известно о динамике кишечной колонизации человека-хозяина. Понимание динамики колонизации имеет решающее значение, потому что отбор по основным признакам E. coli — устойчивости к антибиотикам и вирулентности (склонность вызывать инфекцию) — работает при комменсализме, в кишечнике, а не при инфекциях. Это исследование позволит впервые изучить динамику колонизации E. coli в большой здоровой популяции хозяев. В частности, мы будем количественно определять, как потеря или появление определенных штаммов в кишечнике зависит от свойств хозяина и бактерий. Таким образом, это исследование позволит лучше понять эпидемиологическую динамику кишечной палочки и развитие определенных признаков, таких как устойчивость к антибиотикам.

Основная цель и критерий Основной целью данного исследования является количественная оценка преемственности (появление, потеря или замена) штаммов E. coli в микробиоте кишечника у здоровых добровольцев.

Второстепенные цели и критерии Второстепенной целью является изучение эволюции E. coli внутри хозяина, сосредоточив внимание на эволюции клонов, колонизирующих одного и того же хозяина в течение длительных периодов времени. Это позволяет понять, преобладают ли в эволюции внутри хозяина мутации, дающие избирательное преимущество (например, устойчивость к антибиотикам), или, наоборот, нейтральные мутации (не влияющие на продуцируемые белки).

Популяция. Два этапа этого исследования будут проводиться на здоровых взрослых обоях обоих полов. Здоровые добровольцы будут набраны из списка здоровых добровольцев для биомедицинских исследований в Центре клинических исследований (CIC) больничной группы Биша - Клод Бернар.

Практическая процедура Это исследование будет проходить в два последовательных этапа: Первый, так называемый пилотный этап, сначала будет проводиться на здоровых добровольцах. На этом пилотном этапе будут отобраны 50 здоровых добровольцев, за которыми каждые 2 недели будут брать пробы кала. Пилотный этап будет включать 10 посещений общей продолжительностью 18 недель на одного добровольца. Штаммы, выделенные на этом пилотном этапе, будут секвенированы, что позволит охарактеризовать присутствующие штаммы и возможные изменения штаммов между двумя образцами стула. Ставки преемственности будут оценены. Результаты этого этапа определяют оптимальную частоту дискретизации, обеспечивающую максимальную точность оценки частоты преемственности. Это будет сохранено для второго этапа.

Участие волонтеров, включенных в пилотное исследование, будет разбито на 2 этапа:

1. этап отбора добровольцев в CIC: каждый доброволец будет проходить клиническое обследование для подтверждения его права на участие в исследовании. Он должен соответствовать всем критериям отбора в день этого визита и подписать согласие на сбор;
2. 18-недельный период наблюдения, в течение которого добровольцы отправляются в CIC для сдачи образцов стула каждые две недели в течение 18 недель (соответствует 10 посещениям).

Второй этап, проспективное когортное исследование, также будет проводиться на здоровых добровольцах. Во время этой второй фазы здоровые добровольцы, участвовавшие в первой фазе, смогут продолжить свое участие, и будут отобраны новые добровольцы. к результатам пилотной фазы на срок от 8 до 144 недель максимум.

Участие добровольцев, включенных в когортное исследование, будет разбито на 2 этапа:

1. этап отбора добровольцев в CIC (V1): все участники пройдут клиническое обследование для подтверждения их права на участие в исследовании. Они должны соответствовать всем критериям включения, доступным на день этого визита, и подписать согласие на сбор.
2. период наблюдения максимум 144 недели: 8 контрольных посещений с ритмом от 1 до 18 недель, т.е. максимум от 8 до 144 недель. Добровольцы отправятся в CIC для сдачи образцов стула при каждом из 8 запланированных посещений. График этих 8 посещений будет определен по результатам пилотного этапа.

Количество выбранных субъектов Первая фаза: 50 субъектов Вторая фаза: 200 субъектов, т.е. от 0 до 50 из пилотного этапа + от 150 до 200 новых субъектов, в зависимости от количества добровольцев на пилотном этапе, желающих продолжить.

Количество центров Моноцентрическое национальное исследование: Центр клинических исследований больничной группы Биша – Клода Бернара.

Календарь исследований

1. Первая фаза:

   • продолжительность включения: 6 месяцев (26 недель)
   • продолжительность участия (лечение + последующее наблюдение): 18 недель
   • общая продолжительность: 44 недели

2. Второй этап:

   • продолжительность включения: 18 месяцев (78 недель)
   • продолжительность участия (лечение + последующее наблюдение): от 8 до 144 недель
   • общая продолжительность: от 86 до 222 недель

Статистический анализ Для оценки скорости появления, потери и замещения штаммов E. coli в зависимости от хозяина и бактериальных факторов будет проведен статистический анализ с использованием программного обеспечения R во Французском институте здравоохранения и медицинских исследований U722: сначала на 50 добровольцах в пилотный этап, который позволит провести первую оценку этих показателей и, таким образом, определить оптимальный график отбора проб для предполагаемой когортной фазы, а затем для 200 добровольцев на этой второй фазе.

Статистическая модель, используемая для двух анализов, будет описывать динамику колонизации хозяина. Мы будем предполагать, что состояние колонизации хоста следует цепи Маркова с дискретными состояниями в непрерывном времени. Эта математическая модель описывает переходы между различными возможными состояниями путем усиления деформации, потери деформации и замены деформации внутри узла. Он вычисляет вероятность того, что данные будут получены, зная параметры (прирост деформации, потеря деформации, замена деформации) и, следовательно, вероятность (вероятность того, что данные будут известны модели). Исходя из правдоподобия, параметры могут быть оценены методами максимального правдоподобия.

Количественно параметры будут оцениваться по максимальному правдоподобию, а точность будет количественно определяться доверительными интервалами, полученными методом профиля правдоподобия.

Также будет оцениваться зависимость коэффициентов прироста, потери и замещения от нескольких переменных-хозяев или бактерий. Значимость влияния переменной на коэффициенты прироста, убытка и замещения будет проверена путем сравнения моделей: модели будут скорректированы по максимальному правдоподобию. Сравнение моделей будет проводиться с помощью теста отношения правдоподобия.

Во-первых, будут проверены факторы, которые априори считаются важными для темпов перехода. Уровень значимости этих факторов будет скорректирован для множественных тестов (поправка Бонферрони). На втором этапе воздействие всех элементов генома будет проанализировано исследовательским способом (исследование ассоциаций всего генома).