Studio della Dinamica Ecologica ed Evolutiva di Escherichia Coli nella Flora Commensale Digestiva (EVE)

Escherichia Coli pone un grave problema di salute pubblica. E. Coli non è solo un commensale dell'apparato digerente ma anche un importante patogeno opportunista, prima causa di infezioni delle vie urinarie, prima causa di batteriemia. Tuttavia, si sa poco sulla dinamica della colonizzazione intestinale dell'ospite umano. Comprendere le dinamiche della colonizzazione è fondamentale perché la selezione per i tratti principali di E. coli è la resistenza agli antibiotici e la virulenza (la propensione a causare l'infezione) funziona nel commensalismo, nell'intestino, non nelle infezioni. Questo studio consentirà per la prima volta di studiare le dinamiche di colonizzazione di E. coli in una grande popolazione ospite sana. In particolare, quantificheremo come la perdita o l'aumento di alcuni ceppi nell'intestino dipenda dalle proprietà dell'ospite e dei batteri. Questo studio fornirà quindi una migliore comprensione delle dinamiche epidemiologiche di E. coli e dello sviluppo di alcuni tratti come la resistenza agli antibiotici.

Obiettivo principale e criterio L'obiettivo principale di questa ricerca è quantificare la successione (guadagno, perdita o sostituzione) di ceppi di E. coli nel microbiota intestinale in volontari sani.

Obiettivi e criteri secondari L'obiettivo secondario è studiare l'evoluzione intra-ospite di E. coli concentrandosi sull'evoluzione di cloni che colonizzano lo stesso ospite per lunghi periodi di tempo. Questo permette di capire se l'evoluzione intra-ospite è dominata da mutazioni che conferiscono un vantaggio selettivo (come la resistenza agli antibiotici) o al contrario da mutazioni neutre (che non hanno effetto sulle proteine ​​prodotte).

Popolazione Le due fasi di questo studio saranno condotte su adulti sani di entrambi i sessi. I volontari sani saranno reclutati dal file di volontari sani per la ricerca biomedica presso il Centro di indagine clinica (CIC) del gruppo ospedaliero Bichat - Claude Bernard.

Procedura pratica Questa ricerca si svolgerà in due fasi successive: Una prima fase cosiddetta pilota sarà prima condotta con volontari sani. Durante questa fase pilota, 50 volontari sani saranno selezionati e seguiti ogni 2 settimane per un campione di feci. La fase pilota comprenderà 10 visite per una durata totale di 18 settimane per volontario. I ceppi isolati durante questa fase pilota saranno sequenziati, rendendo possibile la caratterizzazione dei ceppi presenti e le possibili variazioni di ceppi tra due campioni di feci. I tassi di successione saranno stimati. I risultati di questa fase identificano la frequenza di campionamento ottimale che massimizza l'accuratezza nella stima dei tassi di successione. Questo verrà mantenuto per la seconda fase.

La partecipazione dei volontari inclusi nello studio pilota sarà suddivisa in 2 fasi:

1. una fase di selezione dei volontari presso il CIC: ogni volontario sosterrà un esame clinico per accertarne l'idoneità alla partecipazione alla ricerca. Deve soddisfare tutti i criteri di selezione il giorno di questa visita e firmare il consenso alla raccolta;
2. un periodo di follow-up di 18 settimane durante il quale i volontari si recano al CIC per depositare campioni di feci ogni due settimane per 18 settimane (corrispondenti a 10 visite).

Una seconda fase, uno studio prospettico di coorte, sarà condotto anche su volontari sani. Durante questa seconda fase, i volontari sani che hanno partecipato alla prima fase potranno continuare la loro partecipazione e verranno selezionati nuovi volontari. I volontari sani inclusi nello studio prospettico di coorte saranno seguiti con visite e campioni di feci che saranno definiti in base ai risultati della fase pilota per un periodo da 8 a 144 settimane al massimo.

La partecipazione dei volontari inclusi nello studio di coorte sarà suddivisa in 2 fasi:

1. uno stage per la selezione dei volontari presso il CIC (V1): tutti i partecipanti sosterranno un esame clinico per accertarne l'idoneità alla partecipazione alla ricerca. Devono soddisfare tutti i criteri di inclusione disponibili il giorno di questa visita e firmare il consenso alla raccolta.
2. un periodo di follow-up di massimo 144 settimane: 8 visite di follow-up con un ritmo da 1 a 18 settimane, cioè da 8 a 144 settimane al massimo. I volontari si recheranno al CIC per depositare campioni di feci in ognuna delle 8 visite previste. Il programma di queste 8 visite sarà determinato sulla base dei risultati della fase pilota.

Numero di soggetti selezionati Prima fase: 50 soggetti Seconda fase: 200 soggetti, ovvero da 0 a 50 della fase pilota + da 150 a 200 nuovi soggetti, a seconda del numero di volontari della fase pilota che desiderano continuare.

Numero di centri Studio nazionale monocentrico: Centro di ricerca clinica del gruppo ospedaliero Bichat - Claude Bernard.

Calendario delle ricerche

1. Prima fase:

   • durata dell'inclusione: 6 mesi (26 settimane)
   • durata della partecipazione (trattamento + follow-up): 18 settimane
   • durata totale: 44 settimane

2. Seconda fase:

   • durata dell'inclusione: 18 mesi (78 settimane)
   • durata della partecipazione (trattamento + follow-up): da 8 a 144 settimane
   • durata totale: da 86 a 222 settimane

Analisi statistica Per stimare i tassi di guadagno, perdita e sostituzione dei ceppi di E. coli a seconda dell'ospite e dei fattori batterici, verranno eseguite analisi statistiche utilizzando il software R all'interno dell'Istituto francese per la salute e la ricerca medica U722: prima sui 50 volontari nel fase pilota, che consentirà una prima stima di questi tassi e definirà quindi il programma di campionamento ottimale per la fase prospettica di coorte, quindi sui 200 volontari di questa seconda fase.

Il modello statistico utilizzato per le due analisi descriverà le dinamiche della colonizzazione dell'ospite. Assumeremo che lo stato di colonizzazione dell'ospite segua una catena di Markov a stati discreti in tempo continuo. Questo modello matematico descrive le transizioni tra i diversi stati possibili, mediante guadagno di deformazione, perdita di deformazione e sostituzione di deformazione all'interno dell'ospite. Calcola la probabilità dei dati ottenuti conoscendo i parametri (strain gains, strain loss, strain replacement) e quindi la verosimiglianza (la probabilità dei dati conoscendo il modello). Dalla verosimiglianza, i parametri possono essere stimati con metodi di massima verosimiglianza.

Quantitativamente, i parametri saranno stimati con la massima verosimiglianza e la precisione sarà quantificata mediante intervalli di confidenza ottenuti con il metodo del profilo di verosimiglianza.

Verrà inoltre stimata la dipendenza dei tassi di guadagno, perdita e sostituzione da diverse variabili dell'ospite o batteriche. La significatività dell'effetto di una variabile sui tassi di guadagno, perdita e sostituzione sarà testata mediante confronto tra modelli: i modelli saranno aggiustati in base alla massima verosimiglianza. Il confronto dei modelli sarà effettuato mediante il test del rapporto di verosimiglianza.

In primo luogo, verranno testati i fattori che si sospettano a priori importanti per i tassi di transizione. Il livello di significatività di questi fattori sarà corretto per test multipli (correzione di Bonferroni). In una seconda fase, l'impatto di tutti gli elementi del genoma sarà analizzato in modo esplorativo (studio di associazione su tutto il genoma).