Etude de la dynamique écologique et évolutive d'Escherichia Coli dans la flore commensale digestive (EVE)

Escherichia Coli pose un problème majeur de santé publique. E. Coli n'est pas seulement un commensal du tube digestif mais aussi un pathogène opportuniste majeur, première cause d'infections urinaires, première cause de bactériémie. Cependant, on sait peu de choses sur la dynamique de la colonisation intestinale de l'hôte humain. Comprendre la dynamique de la colonisation est crucial car la sélection des principaux traits d'E. coli est la résistance aux antibiotiques et la virulence (la propension à provoquer une infection) fonctionne dans le commensalisme, dans l'intestin, pas dans les infections. Cette étude permettra pour la première fois d'étudier la dynamique de colonisation d'E. coli dans une large population d'hôtes sains. En particulier, nous quantifierons comment la perte ou le gain de certaines souches dans l'intestin dépend des propriétés de l'hôte et de la bactérie. Cette étude permettra ainsi de mieux comprendre la dynamique épidémiologique d'E. coli et le développement de certains traits comme la résistance aux antibiotiques.

Objectif principal et critère L'objectif principal de cette recherche est de quantifier la succession (gain, perte ou remplacement) de souches d'E. coli dans le microbiote intestinal chez des volontaires sains.

Objectifs et critères secondaires L'objectif secondaire est d'étudier l'évolution intra-hôte d'E. coli en se concentrant sur l'évolution des clones colonisant le même hôte pendant de longues périodes. Ceci permet de comprendre si l'évolution intra-hôte est dominée par des mutations conférant un avantage sélectif (comme la résistance aux antibiotiques) ou au contraire des mutations neutres (n'ayant aucun effet sur les protéines produites).

Population Les deux phases de cette étude seront menées chez des adultes sains des deux sexes. Des volontaires sains seront recrutés à partir du fichier des volontaires sains pour la recherche biomédicale au Centre d'Investigation Clinique (CIC) du groupe hospitalier Bichat - Claude Bernard.

Déroulement pratique Cette recherche se déroulera en deux phases successives : Une première phase dite pilote sera d'abord menée auprès de volontaires sains. Au cours de cette phase pilote, 50 volontaires sains seront sélectionnés et suivis toutes les 2 semaines pour un prélèvement de selles. La phase pilote comprendra 10 visites pour une durée totale de 18 semaines par volontaire. Les souches isolées lors de cette phase pilote seront séquencées, permettant de caractériser les souches présentes et les éventuels changements de souches entre deux prélèvements de selles. Les taux de succession seront estimés. Les résultats de cette phase identifient le taux d'échantillonnage optimal qui maximise la précision dans l'estimation des taux de succession. Celle-ci sera conservée pour la seconde phase.

La participation des volontaires inclus dans l'étude pilote se décomposera en 2 étapes :

1. une étape de sélection des volontaires au CIC : chaque volontaire subira un examen clinique pour s'assurer de son éligibilité à participer à la recherche. Il doit répondre à tous les critères de sélection le jour de cette visite et signer le consentement de collecte ;
2. une période de suivi de 18 semaines pendant laquelle les volontaires se rendent au CIC pour déposer des échantillons de selles toutes les deux semaines pendant 18 semaines (correspondant à 10 visites).

Une deuxième phase, une étude de cohorte prospective sera également menée chez des volontaires sains. Au cours de cette deuxième phase, les volontaires sains ayant participé à la première phase pourront poursuivre leur participation et de nouveaux volontaires seront sélectionnés. Les volontaires sains inclus dans l'étude de cohorte prospective seront suivis par des visites et des prélèvements de selles qui seront définis en fonction aux résultats de la phase pilote pendant une durée de 8 à 144 semaines maximum.

La participation des volontaires inclus dans l'étude de cohorte se décomposera en 2 étapes :

1. une étape de sélection des volontaires au CIC (V1) : tous les participants subiront un examen clinique pour s'assurer de leur éligibilité à participer à la recherche. Ils doivent répondre à tous les critères d'inclusion disponibles au jour de cette visite et signer le consentement de collecte.
2. une période de suivi de 144 semaines maximum : 8 visites de suivi avec un rythme de 1 à 18 semaines, soit 8 à 144 semaines max. Les bénévoles se rendront au CIC pour déposer des échantillons de selles à chacune des 8 visites prévues. Le calendrier de ces 8 visites sera déterminé en fonction des résultats de la phase pilote.

Nombre de sujets sélectionnés Première phase : 50 sujets Seconde phase : 200 sujets, soit 0 à 50 de la phase pilote + 150 à 200 nouveaux sujets, selon le nombre de volontaires de la phase pilote qui souhaitent continuer.

Nombre de centres Etude nationale monocentrique : Centre d'Investigation Clinique du groupe hospitalier Bichat - Claude Bernard.

Calendrier de recherche

1. Première phase:

   • durée d'inclusion : 6 mois (26 semaines)
   • durée de participation (traitement + suivi) : 18 semaines
   • durée totale : 44 semaines

2. Seconde phase:

   • durée d'inclusion : 18 mois (78 semaines)
   • durée de participation (traitement + suivi) : 8 à 144 semaines
   • durée totale : 86 à 222 semaines

Analyse statistique Pour estimer les taux de gain, de perte et de remplacement des souches d'E. coli en fonction des facteurs hôtes et bactériens, des analyses statistiques seront réalisées à l'aide du logiciel R au sein de l'Institut français de la santé et de la recherche médicale U722 : dans un premier temps sur les 50 volontaires du phase pilote, qui permettra une première estimation de ces taux et définira ainsi le calendrier d'échantillonnage optimal pour la phase de cohorte prospective, puis sur les 200 volontaires de cette seconde phase.

Le modèle statistique utilisé pour les deux analyses décrira la dynamique de colonisation de l'hôte. Nous supposerons que l'état de colonisation de l'hôte suit une chaîne de Markov à états discrets en temps continu. Ce modèle mathématique décrit les transitions entre les différents états possibles, par gain de contrainte, perte de contrainte et remplacement de contrainte au sein de l'hôte. Il calcule la probabilité des données obtenues connaissant les paramètres (gains de déformation, perte de déformation, remplacement de déformation) et donc la vraisemblance (la probabilité que les données connaissent le modèle). A partir de la vraisemblance, les paramètres peuvent être estimés par des méthodes de maximum de vraisemblance.

Quantitativement, les paramètres seront estimés par maximum de vraisemblance et la précision sera quantifiée par des intervalles de confiance obtenus par la méthode du profil de vraisemblance.

La dépendance des taux de gain, de perte et de remplacement à plusieurs variables hôtes ou bactériennes sera également estimée. La significativité de l'effet d'une variable sur les taux de gain, de perte et de remplacement sera testée par comparaison de modèles : les modèles seront ajustés par maximum de vraisemblance. La comparaison des modèles se fera par test du rapport de vraisemblance.

Premièrement, les facteurs que l'on soupçonne a priori d'être importants pour les taux de transition seront testés. Le niveau de signification de ces facteurs sera corrigé pour plusieurs tests (correction de Bonferroni). Dans un second temps, l'impact de tous les éléments du génome sera analysé de manière exploratoire (genome-wide association study).