Undersøgelse af den økologiske og evolutionære dynamik af Escherichia coli i fordøjelseskanalens kommensalflora (EVE)

Escherichia Coli udgør et stort folkesundhedsproblem. E. Coli er ikke kun en commensal af fordøjelseskanalen, men også en vigtig opportunistisk patogen, første årsag til urinvejsinfektioner, første årsag til bakteriemi. Der er dog lidt kendt om dynamikken i intestinal kolonisering af den menneskelige vært. At forstå dynamikken i kolonisering er afgørende, fordi selektion for de vigtigste træk ved E. coli er antibiotikaresistens og virulens (tilbøjeligheden til at forårsage infektion) virker i kommensalisme, i tarmen, ikke i infektioner. Denne undersøgelse vil gøre det muligt for første gang at studere koloniseringsdynamikken af ​​E. coli i en stor sund værtspopulation. Vi vil især kvantificere, hvordan tabet eller gevinsten af ​​visse stammer i tarmen afhænger af værtens og bakteriernes egenskaber. Denne undersøgelse vil således give en bedre forståelse af E. colis epidemiologiske dynamik og udviklingen af ​​visse egenskaber såsom antibiotikaresistens.

Hovedformål og kriterium Hovedformålet med denne forskning er at kvantificere successionen (forøgelse, tab eller erstatning) af E. coli-stammer i tarmmikrobiotaen hos raske frivillige.

Sekundære mål og kriterier Det sekundære mål er at studere intra-værts udvikling af E. coli ved at fokusere på udviklingen af ​​kloner, der koloniserer den samme vært i lange perioder. Dette gør det muligt at forstå, om intra-vært-evolutionen er domineret af mutationer, der giver en selektiv fordel (såsom resistens over for antibiotika) eller tværtimod neutrale mutationer (som ikke har nogen effekt på de producerede proteiner).

Population De to faser af denne undersøgelse vil blive udført i raske voksne af begge køn. Sunde frivillige vil blive rekrutteret fra filen af ​​raske frivillige til biomedicinsk forskning på Clinical Investigation Center (CIC) i Bichat - Claude Bernard hospitalsgruppen.

Praktisk procedure Denne forskning vil foregå i to på hinanden følgende faser: En første såkaldt pilotfase vil først blive gennemført med raske frivillige. I løbet af denne pilotfase vil 50 raske frivillige blive udvalgt og fulgt hver 2. uge til en afføringsprøve. Pilotfasen vil omfatte 10 besøg i en samlet varighed på 18 uger pr. frivillig. De stammer, der er isoleret i denne pilotfase, vil blive sekventeret, hvilket gør det muligt at karakterisere de tilstedeværende stammer og de mulige ændringer af stammer mellem to afføringsprøver. Successionsrater vil blive estimeret. Resultaterne af denne fase identificerer den optimale samplingshastighed, der maksimerer nøjagtigheden ved estimering af successionsrater. Dette vil blive bibeholdt i anden fase.

Deltagelsen af ​​de frivillige inkluderet i pilotundersøgelsen vil blive opdelt i 2 faser:

1. en fase af frivillige udvælgelse på CIC: hver frivillig vil have en klinisk undersøgelse for at sikre, at de er berettiget til at deltage i forskningen. Han skal opfylde alle udvælgelseskriterierne på dagen for dette besøg og underskrive indsamlingstilladelsen;
2. en 18-ugers opfølgningsperiode, hvor de frivillige går til CIC for at deponere afføringsprøver hver anden uge i 18 uger (svarende til 10 besøg).

En anden fase, et prospektivt kohortestudie vil også blive udført med raske frivillige. I denne anden fase vil raske frivillige, der deltog i første fase, kunne fortsætte deres deltagelse, og nye frivillige vil blive udvalgt. De raske frivillige, der indgår i det prospektive kohortestudie, vil blive fulgt op med besøg og afføringsprøver, som vil blive defineret iht. til resultaterne af pilotfasen i en periode på højst 8 til 144 uger.

Deltagelsen af ​​frivillige inkluderet i kohorteundersøgelsen vil blive opdelt i 2 faser:

1. en fase for udvælgelsen af ​​frivillige på CIC (V1): alle deltagere vil have en klinisk undersøgelse for at sikre deres berettigelse til deltagelse i forskningen. De skal opfylde alle de inklusionskriterier, der er tilgængelige på dagen for dette besøg og underskrive indsamlingstilladelsen.
2. en opfølgningsperiode på maks. 144 uger: 8 opfølgningsbesøg med en rytme på 1 til 18 uger, dvs. max. 8 til 144 uger. De frivillige vil gå til CIC for at deponere afføringsprøver ved hvert af de 8 planlagte besøg. Tidsplanen for disse 8 besøg vil blive fastlagt på baggrund af resultaterne af pilotfasen.

Antal valgte emner Første fase: 50 forsøgspersoner Anden fase: 200 forsøgspersoner, dvs. 0 til 50 fra pilotfasen + 150 til 200 nye forsøgspersoner, afhængig af antallet af frivillige i pilotfasen, der ønsker at fortsætte.

Antal centre Monocentrisk national undersøgelse: Clinical Investigation Center for Bichat - Claude Bernard hospitalsgruppen.

Forskningskalender

1. Første fase:

   • varighed af inklusion: 6 måneder (26 uger)
   • varighed af deltagelse (behandling + opfølgning): 18 uger
   • samlet varighed: 44 uger

2. Anden fase:

   • varighed af inklusion: 18 måneder (78 uger)
   • varighed af deltagelse (behandling + opfølgning): 8 til 144 uger
   • samlet varighed: 86 til 222 uger

Statistisk analyse For at estimere hastigheden for tilvækst, tab og udskiftning af E. coli-stammer afhængigt af værts- og bakteriefaktorer, vil statistiske analyser blive udført ved hjælp af R-software inden for det franske institut for sundhed og medicinsk forskning U722: først på de 50 frivillige i pilotfase, som vil tillade et første estimat af disse rater og dermed definere den optimale prøveudtagningsplan for den fremtidige kohortefase, derefter på de 200 frivillige i denne anden fase.

Den statistiske model, der er brugt til de to analyser, vil beskrive dynamikken i værtskolonisering. Vi vil antage, at værtskoloniseringsstaten følger en diskret-stats Markov-kæde i kontinuerlig tid. Denne matematiske model beskriver overgangene mellem de forskellige mulige tilstande, ved stammeforstærkning, stammetab og stammeerstatning i værten. Den beregner sandsynligheden for, at de opnåede data kender parametrene (strain gains, strain tab, strain erstatning) og derfor sandsynligheden (sandsynligheden for, at dataene kender modellen). Ud fra sandsynligheden kan parametrene estimeres ved maksimal sandsynlighedsmetoder.

Kvantitativt vil parametrene blive estimeret ved maksimal sandsynlighed, og præcisionen vil blive kvantificeret ved konfidensintervaller opnået med sandsynlighedsprofilmetoden.

Afhængigheden af ​​forstærknings-, tabs- og erstatningsraterne af flere værts- eller bakterievariable vil også blive estimeret. Betydningen af ​​effekten af ​​en variabel på gevinst-, tabs- og erstatningsraterne vil blive testet ved modelsammenligning: modellerne vil blive justeret efter maksimal sandsynlighed. Sammenligningen af ​​modeller vil blive udført ved sandsynlighedsforholdstest.

Først vil de faktorer, der på forhånd mistænkes for at være vigtige for overgangsrater, blive testet. Signifikansniveauet af disse faktorer vil blive korrigeret for flere tests (Bonferroni-korrektion). I et andet trin vil virkningen af ​​alle elementer i genomet blive analyseret på en eksplorativ måde (genomdækkende associationsundersøgelse).