FGF19 v obstrukční cholestáze: „Odhalte signál“ (FOCUS)

Protože žlučové soli jsou biologické emulgátory, hrají zásadní roli při trávení a vstřebávání lipidů a vitamínů rozpustných v tucích. Žlučové soli také působí jako silné signální molekuly zacílené na žlučové soli snímající nukleární a plazmatické buněčné membrány vázané receptory. Aktivací těchto receptorů je ovlivněno několik metabolických a biologických procesů, včetně homeostázy žlučových solí a glukózy, termogeneze, funkce střevní bariéry a regenerace jater.

Žlučové soli jsou syntetizovány v játrech a účinně se vracejí do jater přes střevní lumen a portální krev (enterohepatální oběh = EHC). Obsah jaterní žlučové soli je přísně regulován na několika úrovních, aby se udržely netoxické úrovně. Transkripční faktor Farnesoid X Receptor (FXR) hraje klíčovou roli v homeostáze žlučových solí regulací syntézy, biliární exkrece, střevního zpětného vychytávání a metabolismu žlučových solí. Genetický nedostatek FXR u myší má za následek zhoršenou funkci střevní bariéry, dysregulovaný jaterní metabolismus a zhoršené zotavení z cholestatického poškození jater. Žlučové soli potlačují svou vlastní biosyntézu a to zahrnuje aktivaci FXR žlučovými solemi v enterohepatické tkáni a řízení transkripce Cyp7a1 v játrech (enzym omezující rychlost syntézy žlučových solí). Aktivovaný jaterní FXR potlačuje syntetický enzym Cyp7a1 žlučové soli indukcí exprese Shp. Na druhé straně aktivovaný FXR v ileu indukuje expresi FGF19, který signalizuje játrům, aby potlačily expresi Cyp7a1. Játra jsou považována za primární cíl FGF19, protože exprimují obě složky komplexu FGF19-receptor (FGFR4-βklotho). Pokusy na zvířatech prokázaly zásadní roli střevního FXR při prevenci přerůstání bakterií a udržování střevní integrity na myším modelu obstrukční cholestázy. Kromě toho aktivace střevního FXR zlepšila cholestatické poškození jater u myší s ligací žlučovodu. To zdůrazňuje, že intaktní EHC je zásadní pro udržení tkáňové homeostázy v tenkém střevě a játrech.

U pacientů s obstrukční cholestázou (např. rakovina slinivky břišní a cholangiokarcinom). S těmito anomáliemi je spojena absence žluči ve střevním traktu. Výzkumníci předpokládají, že normální tok žluči u pacientů s obstrukční cholestázou je narušen, a proto je narušena signalizace žlučových solí, což vede k dysregulaci v enterohepatálních tkáních. Abychom dále zlepšili naše chápání signalizace žlučové soli-FGF19 napříč různými břišními orgány, získají výzkumníci vzorky krve nejen z radiální tepny, vrátnice a jaterní žíly, ale také z horní mesenterické žíly, dolní mesenterické žíly, sleziny. žíly a renální žíly. Zahrnutím těchto krevních cév budou vědci schopni získat informace o podílu tenkého střeva, tlustého střeva, sleziny a ledvin, a to odděleně při produkci nebo extrakci FGF19 u lidí. Jmenovitě arteriovenózní rozdíly (AAV) a čisté toky orgánů (průtok x ΔAV) slouží jako kvantitativní měřítko výměny metabolitů přes portálně drenážované viscery (PDV), splanchnickou oblast a tenké střevo, tlusté střevo, slezinu a ledviny.

Hypotézou je, že tok FGF19 mezi orgány se během obstrukční cholestázy posouvá směrem k produkci nebo uvolňování FGF19 jinými břišními orgány spíše než tenkým střevem. Elevace FGF19 v séru a exprese mRNA FGF19 v játrech pacientů s obstrukční cholestázou tento koncept podporují.

Cílem této studie je prozkoumat signalizaci FGF19 u pacientů s cholestázou ve srovnání s necholestatickými pacienty pomocí výpočtu toků přes portálně drénované orgány. Za druhé, výzkumníci budou zkoumat metabolické a funkční důsledky (glukóza, homeostáza lipidů, cholestatické svědění, funkce střevní bariéry, složení žlučových solí) narušené dráhy FXR-FGF19 u lidí. Zjištění z této studie poskytnou nové poznatky o signalizaci enterohepatální žlučové soli-FGF19 u lidí a mohou vést k potenciálním terapeutickým strategiím u cholestatických onemocnění jater.

Primární cíl

• Stanovte in vivo meziorgánové toky FGF19 u pacientů s obstrukční cholestázou ve srovnání s necholestatickými pacienty a drénovanými pacienty

Sekundární cíle

• Stanovte orgánové toky žlučových solí (druhy) u pacientů s obstrukční cholestázou ve srovnání s necholestatickými pacienty (kontrolní skupina) a drénovanými pacienty (obnovená EHC skupina)
• Stanovte genovou expresi genů zapojených do signalizace žlučových solí a FGF19 v enterohepatálních tkáních (játra, jejunu, žlučníku, společném žlučovodu, bílé tukové tkáni) a tkáni kosterního svalstva pacientů s obstrukční cholestázou ve srovnání s necholestatickými pacienty (kontrolní skupina) a vyčerpaní pacienti (obnovená skupina EHC).
• Stanovte mikrobiotu pacientů s obstrukční cholestázou ve srovnání s necholestatickými pacienty (kontrolní skupina) a drénovanými pacienty (skupina s obnovenou EHC) v předoperační stolici a intraluminálním obsahu stolice během operace.
• Stanovte složení žlučových solí u pacientů s necholestatickými pacienty (kontrolní skupina) a drénovaných pacientů (skupina s obnovenou EHC) v plazmě, moči a žluči.
• Určete, zda toky metabolitů (např. žlučové soli, FGF19) souvisí s cholestatickým svěděním

Od pacientů účastnících se studie bude odebrána i) krev, ii) tkáň z resekovaného materiálu, iii) žluč, iv) stolice, v) moč, vi) obsah jejuna a vii) informace o závažnosti svědění. Vzhledem k tomu, že níže uvedené krevní cévy jsou snadno dostupné u pacientů podstupujících pankreatikoduodenektomii zachovávající pylorus (pp Whipple) nebo resekci jater, jsou tito pacienti způsobilí pro studii a budou zahrnuti. Před odběrem krve bude průtok krve portální žílou a jaterní tepnou okamžitě změřen průtokoměrem Transonic. Krev bude odebrána z následujících nádob:

portální žíla, jaterní žíla, horní mezenterická žíla, dolní mezenterická žíla, slezinná žíla, renální žíla, radiální tepna

Arteriovenózní rozdíly (ΔAV) a čisté toky orgánů (průtok x ΔAV) jsou kvantitativním měřítkem úlohy jater, PDV, splanchnické oblasti, tenkého střeva, tlustého střeva, sleziny a ledvin při produkci nebo extrakci FGF19 a žlučových solí. Toky budou vypočítány měřením plazmatických hladin metabolitů a stanovením průtoku krve v těchto cévách.

Všichni pacienti podstupující pp Whipple nebo resekci jater mají během operace arteriální katétr, ze kterého mohou vyšetřovatelé odebírat krev. Uvedené žíly (6x) budou napíchnuty přímo pomocí 25G jehel. Během operace bude jednorázově odebráno 10 ml arteriální krve a 10 ml nitrobřišní krve z různých cév zvlášť, takže celkové množství odebrané krve bude maximálně 70 ml. Všechny krevní vzorky budou odebírány jak do předem vychlazených EDTA, tak do heparinizovaných vakuových zkumavek a centrifugovány při 3500 otáčkách za minutu při 4 °C po dobu 10 minut. Plazma bude až do další analýzy skladována v Eppendorfových nádobách při -80 °C. Průtok krve bude měřen pomocí intraoperační duplexní ultrasonografie.

Tkáně budou zkoumány pomocí histologie (histochemie, imunohistochemie/fluorescenční) a pro podrobnou analýzu genů zapojených do signalizace a metabolických procesů žlučová sůl-FGF19 (např. homeostáza glukózy, homeostáza lipidů). Během operace budou odebrány následující tkáně (z resekovaného materiálu), což umožní podrobné studium genů zapojených do signalizace žlučové soli-FGF19 v enterohepatálních tkáních:

vzorek jater (v případě resekce jater), vzorek žlučníku, vzorek společného žlučovodu, vzorek proximálního jejuna (v případě hepaticojejunostomie při chirurgickém zákroku), bílá tuková tkáň (WAT) [subkutánní, omentální, viscerální], přímý břišní sval

Předchozí studie ukázala, že lidská žluč obsahuje vysoké hladiny FGF19. Přesná funkční role FGF19 ve žluči však není známa. Proto bude žluč odebírána během operace, aby se prozkoumal účinek obstrukční cholestázy na hladiny FGF19 ve žluči. Žluč bude odebírána punkcí žlučníku po odstranění nebo z jaterního žlučovodu v případě, že žlučník není in situ.

Střevní mikroflóra hraje hlavní roli v homeostáze žlučových solí sekundární modifikací a dekonjugací primárních žlučových solí. Mikrobiální složení (např. bude analyzován posun v bakteriích produkujících hydrolázu žlučových solí) předoperační stolice a obsahu proximálního jejuna během operace. Plazma ze tří skupin pacientů (kontrolní, drénovaná a cholestatická) bude analyzována na markery funkce enterocytů (např. citrulin) a poškození enterocytů (např. IFABP), transmurální poškození (SM22), endotoxiny (LBP), prozánětlivé cytokiny (IL-6 a TNF-alfa) a nové markery zánětu jater (kathepsin).

Cholestatický pruritus (svědění) je častý u pacientů s obstrukční cholestázou. Zdroj svědění je v současnosti neznámý a žlučové soli se podílejí na rozvoji cholestatického svědění. Vyšetřovatelé by proto rádi požádali pacienty, aby hodnotili intenzitu svědění den před operací pomocí vizuální analogové škály (VAS, škála od 0 (žádné svědění) do 10 (nejhorší možné svědění)). Kromě toho je vyšetřovatelé požádají o vyplnění krátkého dotazníku, 5D stupnice svědění. Metabolity podílející se na svědění (např. žlučové soli) budou analyzovány ve vzorcích krve pro výpočet toků a ty budou korelovány s předoperačním skóre VAS a 5D stupnicí svědění.

U všech pacientů bude také před operací odebírána moč, aby se zjistilo, zda cholestáza ovlivňuje cestu vylučování žlučových solí (od vylučování žlučí k vylučování ledvinami). Složení žlučových solí bude analyzováno v moči pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS).

Hlavní parametry studie/koncové body: Hlavním parametrem studie je čistý orgánový tok FGF19 přes břišní orgány vypočítaný měřením hladin FGF19 v lidské plazmě pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA) u cholestatických versus necholestatických pacientů a pacientů s drenáží . Lidská plazma bude během operace získána ze 7 cév i) radiální arterie, ii) mezenterické horní žíly, iii) mezenterické dolní žíly, iv) renální žíly, v) slezinné žíly, vi) jaterní žíly a vii) portální žíly pro výpočet čistého orgánu tavidla. Sekundární parametry jsou exprese genů souvisejících se žlučovou solí a signalizací FGF19 v enterohepatálních tkáních (játra, jejunum, žlučník, společný žlučovod, bílá tuková tkáň a tkáň kosterního svalstva), geny podílející se na homeostáze glukózy a lipidů, hladiny FGF19 ve žluči, střevě mikrobiota, cholestatické svědění a složení žlučových solí v moči.

Povaha a rozsah zátěže a rizik spojených s účastí, přínosem a skupinovou příbuzností: Jsou zahrnuti pacienti plánovaní na Whippleovu proceduru nebo resekci jater. Informovaný souhlas bude získán buď na ambulanci, nebo v den přijetí s týdenním časem na rozhodnutí. Pacienti pak budou mít také čas na dotazy.

Krev těmto pacientům bude během operace v celkové anestezii odebrána z portální žíly, jaterní žíly, horní mezenterické žíly, dolní mezenterické žíly, slezinové žíly, renální žíly a radiální tepny. Experimentální uspořádání sestává z 1x odběru arteriální krve (10ml) a 1x odběru nitrobřišní krve (6x10ml), což je celkem maximálně 70 ml. Během operace bude měřen průtok krve portální žílou a jaterní tepnou, aby bylo možné přesně vypočítat průtoky orgány. Portální žíla a jaterní tepna jsou snadno přístupné pro měření průtoku pomocí průtokoměru Transonic. Toto zařízení je certifikováno CE a běžně se používá k měření skutečného průtoku krve. S měřením těchto krevních toků nejsou spojena žádná rizika.

Kromě toho bude během operace odebrán vzorek žluči (4 ml) ze žlučníku nebo jaterního vývodu během operace a budou odebrány biopsie z jater (1, v případě resekce jater), žlučníku (1), jejuna (1, v případě hepaticojejunostomie), společný žlučovod (CBD, 1). bílá tuková tkáň (WAT, ze tří míst; podkožní, omentální a viscerální tuková tkáň) a přímý břišní sval pro studie genové exprese genů. Kromě toho bude odebrána perioperační stolice a moč a obsah jejuna během operace (v případě hepaticojejunostomie) pro podrobnou analýzu složení mikrobioty/žlučových solí, aby se prozkoumal účinek obstrukční cholestázy na tyto parametry. U pacientů bude den před operací hodnocena závažnost svědění pomocí dotazníku (vizuální analogová stupnice a 5D stupnice svědění), aby se korelovaly toky s cholestatickým svěděním.

Používané metody, tj. odběry arteriální a nitrobřišní krve a odběr jaterních/jejunálních biopsií v rámci plánované resekce, byly dříve používány bez jakýchkoliv následků pro operační výkony nebo pacienty. Ve srovnání s dříve eticky schválenými protokoly bude během operace odebrán vzorek žluči (4 ml) ze žlučníku nebo jaterního vývodu a budou odebrány biopsie žlučníku (1x), CBD (1x) a WAT ​​(3x) a také stolice. odebrané jednou před operací. Neexistují žádná další rizika související s odběrem žluči a tkání, protože jsou součástí resekovaných tkání. Biopsie tenkého střeva, bílé tukové tkáně a přímého břišního svalu bude odebrána z částí, které budou resekovány během operace nebo z místa chirurgického řezu, čímž se zabrání riziku trvalých komplikací. Případné peroperační krvácení tkáně chirurg elektrokoaguluje. Břišní biopsie budou odebírány zkušenými hepatopankreatikobiliárními chirurgy. Se sběrem předoperační stolice a moči není spojeno žádné další riziko. Přestože výsledky tohoto projektu nemají žádné přímé pozitivní účinky na zúčastněné pacienty, přispívají k pochopení role žlučových solí a signalizace FGF19 za cholestatických podmínek. Poznatky z této studie by poskytly novinku a podstatné znalosti o možných účincích terapie FGF19 při cholestatickém poškození jater.