FGF19 при обструктивном холестазе: «Раскрыть сигнал» (FOCUS)

Поскольку соли желчных кислот являются биологическими эмульгаторами, они играют важную роль в переваривании и всасывании пищевых липидов и жирорастворимых витаминов. Соли желчных кислот также действуют как мощные сигнальные молекулы, нацеленные на чувствительные к солям желчных кислот ядерные рецепторы и рецепторы, связанные с плазматической клеточной мембраной. Активация этих рецепторов влияет на несколько метаболических и биологических процессов, включая гомеостаз желчных солей и глюкозы, термогенез, барьерную функцию кишечника и регенерацию печени.

Желчные соли синтезируются в печени и эффективно возвращаются в печень через просвет кишечника и портальную кровь (энтерогепатическая циркуляция = EHC). Содержание солей в печеночной желчи жестко регулируется на нескольких уровнях, чтобы поддерживать нетоксичные уровни. Фактор транскрипции Farnesoid X Receptor (FXR) играет ключевую роль в гомеостазе солей желчных кислот, регулируя синтез, экскрецию с желчью, обратный захват в кишечнике и метаболизм солей желчных кислот. Генетический дефицит FXR у мышей приводит к нарушению барьерной функции кишечника, нарушению регуляции печеночного метаболизма и нарушению восстановления после холестатического повреждения печени. Соли желчных кислот подавляют свой собственный биосинтез, и это включает активацию FXR солями желчных кислот в энтерогепатической ткани и контроль транскрипции Cyp7a1 в печени (фермент, ограничивающий скорость синтеза солей желчных кислот). Активированный печеночный FXR репрессирует синтетический фермент желчных солей Cyp7a1, индуцируя экспрессию Shp. С другой стороны, активированный FXR в подвздошной кишке индуцирует экспрессию FGF19, который сигнализирует печени подавлять экспрессию Cyp7a1. Первичной мишенью для FGF19 считается печень, поскольку она экспрессирует оба компонента комплекса FGF19-рецептор (FGFR4-βklotho). Эксперименты на животных продемонстрировали решающую роль кишечного FXR в предотвращении избыточного бактериального роста и поддержании целостности кишечника в мышиной модели обструктивного холестаза. Более того, активация кишечного FXR улучшала холестатическое повреждение печени у мышей с перевязанными желчными протоками. Это подчеркивает, что интактный EHC имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей в тонкой кишке и печени.

Интралюминальный бактериальный рост, транслокация микробных эндотоксинов, повышенная проницаемость кишечника, активация кишечных и печеночных воспалительных каскадов и эндотоксемия часто наблюдаются у пациентов с обструктивным холестазом (например, рак поджелудочной железы и холангиокарцинома). С этими аномалиями связано отсутствие желчи в кишечном тракте. Исследователи постулируют, что нормальный поток желчи у пациентов с обструктивным холестазом нарушен и, следовательно, нарушена передача сигналов желчных солей, что приводит к дисрегуляции в энтерогепатических тканях. Чтобы еще больше улучшить наше понимание передачи сигналов желчных солей-FGF19 через различные органы брюшной полости, исследователи получат образцы крови не только из лучевой артерии, воротной и печеночной вены, но также из верхней брыжеечной вены, нижней брыжеечной вены, селезеночной вены. вена и почечная вена. Включив эти кровеносные сосуды, исследователи смогут получить информацию о вкладе тонкой кишки, толстой кишки, селезенки и почек по отдельности в производство или экстракцию FGF19 у людей. А именно, артериовенозные различия (ΔAV) и чистые потоки органов (поток x ΔAV) служат количественной мерой обмена метаболитов через портальные дренированные внутренние органы (PDV), область внутренних органов и тонкую кишку, толстую кишку, селезенку и почки.

Гипотеза состоит в том, что межорганный поток FGF19 смещается во время обструктивного холестаза в сторону производства или высвобождения FGF19 другими органами брюшной полости, а не тонкой кишкой. Повышение уровня FGF19 в сыворотке и экспрессия мРНК FGF19 в печени пациентов с обструктивным холестазом подтверждают эту концепцию.

Целью этого исследования является изучение передачи сигналов FGF19 у пациентов с холестазом по сравнению с пациентами без холестаза путем расчета потоков через портальные дренированные органы. Во-вторых, исследователи будут изучать метаболические и функциональные последствия (глюкоза, гомеостаз липидов, холестатический зуд, барьерная функция кишечника, состав желчных солей) нарушения пути FXR-FGF19 у людей. Результаты этого исследования позволят по-новому взглянуть на передачу сигналов энтерогепатической желчной соли-FGF19 у людей и могут привести к потенциальным терапевтическим стратегиям при холестатических заболеваниях печени.

Основная цель

• Определить in vivo межорганные потоки FGF19 у пациентов с обструктивным холестазом по сравнению с пациентами без холестаза и пациентами с дренированием.

Второстепенные цели

• Определить органные потоки желчных солей (виды) у пациентов с обструктивным холестазом по сравнению с пациентами без холестаза (контрольная группа) и дренированными пациентами (группа восстановленного ЭГХ)
• Определить экспрессию генов, участвующих в желчных солях и передаче сигналов FGF19, в энтерогепатических тканях (печень, тощая кишка, желчный пузырь, общий желчный проток, белая жировая ткань) и ткани скелетных мышц пациентов с обструктивным холестазом по сравнению с пациентами без холестаза (контрольная группа) и дренированные пациенты (восстановленная группа EHC).
• Определить микробиоту пациентов с обструктивным холестазом по сравнению с пациентами без холестаза (контрольная группа) и дренированными пациентами (группа восстановления EHC) в предоперационном стуле и интраоперационном внутрипросветном фекальном содержимом.
• Определить солевой состав желчных кислот у больных без холестаза (контрольная группа) и у больных с дренированием (группа с восстановленным ЭГХ) в плазме, моче и желчи.
• Определите, являются ли потоки метаболитов (например, желчные соли, FGF19) связаны с холестатическим зудом

У пациентов, участвующих в исследовании, будут собирать i) кровь, ii) ткань резецированного материала, iii) желчь, iv) кал, v) мочу, vi) содержимое тощей кишки и vii) информацию о степени тяжести зуда. Поскольку указанные ниже кровеносные сосуды легко доступны у пациентов, перенесших пилоросохраняющую панкреатодуоденальную резекцию (pp Whipple) или резекцию печени, эти пациенты подходят для исследования и будут включены. Перед забором крови кровоток в воротной вене и печеночной артерии будет немедленно измерен с помощью трансзвукового расходомера крови. Кровь берут из следующих сосудов:

воротная вена, печеночная вена, верхняя брыжеечная вена, нижняя брыжеечная вена, селезеночная вена, почечная вена, лучевая артерия

Артериовенозные различия (ΔAV) и чистые потоки органов (поток x ΔAV) являются количественной мерой роли печени, PDV, чревной области, тонкого кишечника, толстой кишки, селезенки и почек в производстве или экстракции FGF19 и солей желчных кислот. Потоки будут рассчитаны путем измерения уровней метаболитов в плазме и определения кровотока в этих сосудах.

Всем пациентам, перенесшим резекцию pp Whipple или резекцию печени, во время операции устанавливают артериальный катетер, из которого исследователи могут взять кровь. Упомянутые вены (6x) будут проколоты непосредственно иглами 25G. 10 мл артериальной крови и 10 мл интраабдоминальной крови из разных сосудов отдельно берут один раз во время операции, в результате чего общий объем взятой крови составляет максимально 70 мл. Все образцы крови будут собираться как в предварительно охлажденные вакуумные пробирки с ЭДТА, так и в гепаринизированные вакуумные пробирки и центрифугироваться при 3500 об/мин при 4°C в течение 10 минут. Плазма будет храниться в чашках Эппендорф при температуре -80°C до дальнейшего анализа. Кровоток будет измеряться с помощью интраоперационной дуплексной ультрасонографии.

Ткани будут исследованы с помощью гистологии (гистохимия, иммуногистохимия/флуоресценция) и для детального анализа генов, участвующих в передаче сигналов желчной соли-FGF19 и метаболических процессах (например, гомеостаз глюкозы, гомеостаз липидов). Следующие ткани (из резецированного материала) будут собраны во время операции, что позволит детально изучить гены, участвующие в передаче сигналов желчной соли-FGF19 в энтерогепатических тканях:

образец печени (в случае резекции печени), образец желчного пузыря, образец общего желчного протока, образец проксимальной части тощей кишки (в случае гепатикоеюноанастомоза во время операции), белая жировая ткань (WAT) [подкожная, сальниковая, висцеральная], прямая мышца живота

Предыдущее исследование показало, что человеческая желчь содержит высокий уровень FGF19. Однако точная функциональная роль FGF19 в желчи неизвестна. Таким образом, желчь будет собираться во время операции, чтобы исследовать влияние обструктивного холестаза на уровни FGF19 в желчи. Желчь собирают путем пункции желчного пузыря после удаления или из печеночного желчного протока, если желчный пузырь не находится на месте.

Микробиота кишечника играет важную роль в гомеостазе желчных солей путем вторичной модификации и деконъюгации первичных желчных солей. Микробный состав (например, будет проанализирован сдвиг в продуцирующих гидролазу желчных кислот бактерий) предоперационного стула и проксимального содержимого тощей кишки во время операции. Плазма от трех групп пациентов (контрольная, дренированная и холестатическая) будет проанализирована на маркеры функции энтероцитов (например, цитруллин) и повреждение энтероцитов (например, IFABP), трансмуральное повреждение (SM22), эндотоксины (LBP), провоспалительные цитокины (IL-6 и TNF-альфа) и новые маркеры воспаления печени (катепсин).

Холестатический зуд (зуд) часто встречается у пациентов с обструктивным холестазом. Источник зуда в настоящее время неизвестен, и соли желчных кислот участвуют в развитии холестатического зуда. Поэтому исследователи хотели бы попросить пациентов оценить интенсивность зуда за день до операции с помощью визуальной аналоговой шкалы (ВАШ, шкала от 0 (зуд отсутствует) до 10 (сильнейший зуд из возможных)). Кроме того, исследователи попросят их заполнить короткую анкету — шкалу зуда 5D. Метаболиты, вызывающие зуд (например, соли желчных кислот) будут проанализированы в образцах крови для расчета потоков, и они будут коррелированы с предоперационными показателями ВАШ и шкалой зуда 5D.

Перед операцией у всех пациентов также будет собираться моча, чтобы выяснить, влияет ли холестаз на путь экскреции солей желчных кислот (от экскреции с желчью до экскреции почками). Состав желчных солей будет проанализирован в моче с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Основные параметры/конечные точки исследования: Основным параметром исследования является чистый поток FGF19 через органы брюшной полости, рассчитанный путем измерения уровней FGF19 в плазме крови человека с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) у пациентов с холестатическим и не холестатическим синдромом и пациентов с дренированием. . Плазма человека будет получена во время операции из 7 сосудов i) лучевой артерии, ii) верхней брыжеечной вены, iii) нижней брыжеечной вены, iv) почечной вены, v) селезеночной вены, vi) печеночной вены и vii) воротной вены для расчета чистого органа потоки. Вторичными параметрами являются экспрессия генов, связанных с желчными солями и передачей сигналов FGF19 в энтерогепатических тканях (печень, тощая кишка, желчный пузырь, общий желчный проток, белая жировая ткань и ткань скелетных мышц), гены, участвующие в гомеостазе глюкозы и липидов, уровни FGF19 в желчи, кишечнике. микробиоты, холестатического зуда и солевого состава мочи.

Характер и степень бремени и рисков, связанных с участием, пользой и принадлежностью к группе: включены пациенты, которым запланирована операция Уиппла или резекция печени. Информированное согласие будет получено либо в амбулаторном отделении, либо в день госпитализации, а для принятия решения потребуется одна неделя. У пациентов также будет время задать вопросы.

Кровь у этих пациентов будет браться во время операции под общей анестезией из воротной вены, печеночной вены, верхней брыжеечной вены, нижней брыжеечной вены, селезеночной вены, почечной вены и лучевой артерии. Экспериментальная установка состоит из однократного забора артериальной крови (10 мл) и однократного забора интраабдоминальной крови (6х10 мл), что в сумме составляет максимально 70 мл. Во время операции будет измеряться кровоток в воротной вене и печеночной артерии для точного расчета кровотока в органах. Воротная вена и печеночная артерия легко доступны для измерения потока с помощью расходомера Transonic. Это устройство сертифицировано CE и регулярно используется для измерения фактического кровотока. Никакие риски не связаны с измерением этих потоков крови.

Дополнительно во время операции берут желчь (4 мл) из желчного пузыря или печеночного протока во время операции, а биоптаты берут из печени (1, в случае резекции печени), желчного пузыря (1), тощей кишки (1, в случае гепатикоеюноанастомоза), общий желчный проток (ОЖП, 1). белая жировая ткань (WAT, из трех участков; подкожная, сальниковая и висцеральная жировая ткань) и прямая мышца живота для исследований экспрессии генов. Кроме того, периоперационный стул и моча, а также содержимое тощей кишки во время операции (в случае гепатикоеюноанастомоза) будут собираться для детального анализа состава микробиоты/желчных солей для изучения влияния обструктивного холестаза на эти параметры. Пациенты будут оцениваться на предмет серьезности зуда с помощью анкеты (визуальная аналоговая шкала и шкала зуда 5D) за день до операции, чтобы соотнести потоки с холестатическим зудом.

Применяемые методы, то есть забор артериальной и интраабдоминальной крови и забор биоптатов печени/тощей кишки в рамках плановой резекции, применялись ранее без каких-либо последствий для хирургических процедур или пациентов. По сравнению с ранее утвержденными этическими протоколами во время операции будет взят образец желчи (4 мл) из желчного пузыря или печеночного протока, а биопсия желчного пузыря (1x), CBD (1x) и WAT (3x), а также стул будут взяты. собирали один раз перед операцией. Нет дополнительных рисков, связанных со сбором желчи и тканей, поскольку они являются частью резецируемых тканей. Биопсия тонкой кишки, белой жировой ткани и прямой мышцы живота будет взята из частей, которые будут резецированы во время операции, или из места хирургического разреза, что предотвратит риск необратимых осложнений. Хирург проводит электрокоагуляцию ткани при потенциальном послеоперационном кровотечении. Биопсию брюшной полости возьмут опытные гепатопанкреатобилиарные хирурги. Никакой дополнительный риск не связан со сбором предоперационного кала и мочи. Хотя результаты этого проекта не имеют прямого положительного эффекта для пациентов, они способствуют пониманию роли солей желчных кислот и передачи сигналов FGF19 при холестатических состояниях. Выводы из этого исследования обеспечат новизну и существенные знания о возможных эффектах терапии FGF19 при холестатическом поражении печени.