FGF19 na Colestase Obstrutiva: "Revelar o Sinal" (FOCUS)

Como os sais biliares são emulsificantes biológicos, eles desempenham um papel essencial na digestão e absorção de lipídios dietéticos e vitaminas lipossolúveis. Os sais biliares também atuam como moléculas de sinalização potentes visando os receptores de detecção de sais biliares ligados às membranas das células plasmáticas e nucleares. Vários processos metabólicos e biológicos são influenciados pela ativação desses receptores, incluindo sais biliares e homeostase da glicose, termogênese, função da barreira intestinal e regeneração hepática.

Os sais biliares são sintetizados no fígado e retornam eficientemente ao fígado através do lúmen intestinal e do sangue portal (circulação entero-hepática = EHC). O conteúdo de sais biliares hepáticos é rigidamente regulado em vários níveis para manter níveis não tóxicos. O fator de transcrição Farnesoid X Receptor (FXR) desempenha um papel fundamental na homeostase dos sais biliares, regulando a síntese, a excreção biliar, a recaptação intestinal e o metabolismo dos sais biliares. A deficiência genética de FXR em camundongos resulta em função de barreira intestinal prejudicada, metabolismo hepático desregulado e recuperação prejudicada de lesão hepática colestática. Os sais biliares reprimem sua própria biossíntese, e isso abrange a ativação do FXR pelos sais biliares no tecido entero-hepático e o controle da transcrição de Cyp7a1 no fígado (enzima limitante da taxa de síntese de sais biliares). O FXR hepático ativado reprime a enzima sintética dos sais biliares Cyp7a1 induzindo a expressão de Shp. Por outro lado, FXR ativado no íleo induz a expressão de FGF19, que sinaliza ao fígado para reprimir a expressão de Cyp7a1. O fígado é considerado o alvo primário do FGF19, pois expressa ambos os componentes do complexo FGF19-receptor (FGFR4-βklotho). Experimentos com animais demonstraram um papel crucial do FXR intestinal na prevenção do supercrescimento bacteriano e na manutenção da integridade intestinal em um modelo de camundongo de colestase obstrutiva. Além disso, a ativação do FXR intestinal melhorou a lesão hepática colestática em camundongos ligados ao ducto biliar. Isso enfatiza que uma EHC intacta é crucial para manter a homeostase tecidual no intestino delgado e no fígado.

Supercrescimento bacteriano intraluminal, translocação de endotoxinas microbianas, aumento da permeabilidade intestinal, ativação de cascatas inflamatórias intestinais e hepáticas e endotoxemia ocorrem frequentemente em pacientes com colestase obstrutiva (p. câncer de pâncreas e colangiocarcinoma). A ausência de bile no trato intestinal está associada a essas anomalias. Os investigadores postulam que o fluxo biliar normal em pacientes com colestase obstrutiva é prejudicado e, portanto, a sinalização dos sais biliares é prejudicada, levando à desregulação nos tecidos entero-hepáticos. Para melhorar ainda mais nossa compreensão da sinalização do sal biliar-FGF19 em diferentes órgãos abdominais, os investigadores irão obter amostras de sangue não apenas da artéria radial, da veia porta e da veia hepática, mas também da veia mesentérica superior, veia mesentérica inferior, veia esplênica veia e a veia renal. Ao incluir esses vasos sanguíneos, os pesquisadores poderão obter informações sobre a contribuição do intestino delgado, do cólon, do baço e dos rins, separadamente, na produção ou extração do FGF19 em humanos. Ou seja, diferenças arteriovenosas (ΔAV) e fluxos líquidos de órgãos (fluxo x ΔAV) servem como uma medida quantitativa da troca de metabólitos através das vísceras drenadas por portal (PDV), área esplâncnica e intestino delgado, cólon, baço e rins.

A hipótese é que o fluxo interorgânico de FGF19 muda durante a colestase obstrutiva para a produção ou liberação de FGF19 por outros órgãos abdominais, em vez do intestino delgado. A elevação sérica de FGF19 e ​​a expressão de FGF19 mRNA no fígado de pacientes com colestase obstrutiva apóiam esse conceito.

O objetivo deste estudo é investigar a sinalização do FGF19 em pacientes com colestase em comparação com pacientes não colestáticos, calculando os fluxos através dos órgãos drenados portais. Em segundo lugar, os investigadores investigarão as consequências metabólicas e funcionais (glicose, homeostase lipídica, coceira colestática, função de barreira intestinal, composição de sais biliares) de uma via FXR-FGF19 perturbada em humanos. As descobertas deste estudo fornecerão novos insights sobre a sinalização de sais biliares entero-hepáticos-FGF19 em humanos e podem levar a estratégias terapêuticas potenciais em doenças hepáticas colestáticas.

Objetivo primário

• Determinar fluxos interorgânicos in vivo de FGF19 em pacientes com colestase obstrutiva em comparação com pacientes não colestáticos e pacientes drenados

Objetivos secundários

• Determinar fluxos de sais biliares (espécies) de órgãos em pacientes com colestase obstrutiva em comparação com pacientes não colestáticos (grupo controle) e pacientes drenados (grupo EHC restaurado)
• Determinar a expressão gênica de genes implicados no sal biliar e na sinalização de FGF19 em tecidos entero-hepáticos (fígado, jejuno, vesícula biliar, ducto biliar comum, tecidos adiposos brancos) e tecido muscular esquelético de pacientes com colestase obstrutiva em comparação com pacientes não colestáticos (grupo controle) e pacientes drenados (grupo EHC restaurado).
• Determinar a microbiota de pacientes com colestase obstrutiva em comparação com pacientes não colestáticos (grupo controle) e pacientes drenados (grupo EHC restaurado) em fezes pré-operatórias e conteúdo fecal intraluminal intra-operatório.
• Determinar a composição dos sais biliares em pacientes com pacientes não colestáticos (grupo controle) e pacientes drenados (grupo EHC restaurado) no plasma, urina e bile.
• Determine se os fluxos de metabólitos (por exemplo, sais biliares, FGF19) estão relacionados à coceira colestática

Dos pacientes participantes do estudo serão coletados i) sangue, ii) tecido de material ressecado, iii) bile, iv) fezes, v) urina, vi) conteúdo jejunal e vii) informações sobre a gravidade da coceira. Uma vez que os vasos sanguíneos indicados abaixo são facilmente acessíveis em pacientes submetidos a duodenopancreatectomia com preservação do piloro (pp Whipple) ou ressecção hepática, esses pacientes são elegíveis para o estudo e serão incluídos. Antes da coleta de sangue, o fluxo sanguíneo da veia porta e da artéria hepática será medido imediatamente com o medidor de fluxo sanguíneo Transonic. O sangue será coletado dos seguintes vasos:

veia porta, veia hepática, veia mesentérica superior, veia mesentérica inferior, veia esplênica, veia renal, artéria radial

Diferenças arteriovenosas (ΔAV) e fluxos líquidos de órgãos (fluxo x ΔAV) são uma medida quantitativa do papel do fígado, PDV, área esplâncnica, intestino delgado, cólon, baço e rins na produção ou extração de FGF19 e ​​sais biliares. Os fluxos serão calculados medindo os níveis plasmáticos dos metabólitos e determinando o fluxo sanguíneo nesses vasos.

Todos os pacientes submetidos a ressecção hepática ou de Whipple pp têm um cateter arterial durante a cirurgia do qual os investigadores podem coletar amostras de sangue. As veias mencionadas (6x) serão puncionadas diretamente com agulhas 25G. 10 ml de sangue arterial e 10 ml de sangue intra-abdominal dos diferentes vasos separadamente serão amostrados uma vez durante a cirurgia, resultando em uma quantidade total de sangue amostrado de no máximo 70 ml. Todas as amostras de sangue serão coletadas em tubos de vácuo EDTA pré-resfriados e heparinizados e centrifugadas a 3500 rpm a 4°C por 10 minutos. O plasma será armazenado em copos Eppendorf a -80°C até análise posterior. O fluxo sanguíneo será medido usando ultrassonografia Duplex intra-operatória.

Os tecidos serão explorados por histologia (histoquímica, imuno-histoquímica/fluorescente) e para análise detalhada de genes implicados na sinalização de sais biliares-FGF19 e ​​processos metabólicos (por exemplo, homeostase da glicose, homeostase lipídica). Os seguintes tecidos (de material ressecado) durante a cirurgia serão coletados, permitindo o estudo detalhado de genes implicados na sinalização de sais biliares-FGF19 em tecidos entero-hepáticos:

amostra de fígado (em caso de ressecção hepática), amostra de vesícula biliar, amostra de ducto biliar comum, amostra de jejuno proximal (em caso de hepaticojejunostomia durante o procedimento cirúrgico), tecido adiposo branco (WAT) [subcutâneo, omental, visceral], músculo reto abdominal

Estudo anterior mostrou que a bile humana contém altos níveis de FGF19. No entanto, o papel funcional exato do FGF19 na bile não é conhecido. Portanto, a bile será coletada no intraoperatório para investigar o efeito da colestase obstrutiva nos níveis de FGF19 na bile. A bile será coletada por punção da vesícula biliar após a remoção ou do ducto biliar hepático, caso a vesícula biliar não esteja in situ.

A microbiota intestinal desempenha um papel importante na homeostase dos sais biliares por modificação secundária e desconjugação de sais biliares primários. A composição microbiana (por exemplo mudança nas bactérias produtoras de sais biliares hidrolase) de fezes pré-operatórias e conteúdo jejunal proximal durante a cirurgia serão analisados. O plasma dos três grupos de pacientes (controle, drenado e colestático) será analisado para marcadores de função enterocitária (por exemplo, citrulina) e danos nos enterócitos (p. IFABP), dano transmural (SM22), endotoxinas (LBP), citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e TNF-alfa) e novos marcadores para inflamação hepática (Cathepsin).

O prurido colestático (coceira) é comum em pacientes com colestase obstrutiva. A origem da coceira é atualmente desconhecida e os sais biliares estão implicados no desenvolvimento da coceira colestática. Portanto, os investigadores gostariam de pedir aos pacientes que pontuassem a intensidade da coceira no dia anterior à cirurgia por meio de uma Escala Visual Analógica (EVA, uma escala de 0 (sem coceira) a 10 (pior coceira possível)). Além disso, os investigadores pedirão que preencham um pequeno questionário, a escala 5D de coceira. Metabólitos implicados na coceira (p. sais biliares) serão analisados ​​nas amostras de sangue para calcular os fluxos e estes serão correlacionados com os escores VAS pré-operatórios e escala 5D de coceira.

A urina também será coletada no pré-operatório de todos os pacientes para investigar se a colestase influencia a via de excreção de sais biliares (da excreção biliar à excreção renal). A composição dos sais biliares será analisada na urina por cromatografia líquida e espectrometria de massas (LC-MS).

Principais parâmetros/pontos finais do estudo: O principal parâmetro do estudo é o fluxo líquido de FGF19 nos órgãos abdominais calculado pela medição dos níveis de FGF19 no plasma humano usando um ensaio imunoenzimático (ELISA) em pacientes colestáticos versus não colestáticos e pacientes drenados . O plasma humano será obtido durante a cirurgia de 7 vasos i) artéria radial, ii) veia mesentérica superior, iii) veia mesentérica inferior, iv) veia renal, v) veia esplênica, vi) veia hepática e vii) veia porta para calcular o órgão líquido fluxos. Os parâmetros secundários são a expressão de genes relacionados ao sal biliar e sinalização de FGF19 em tecidos entero-hepáticos (fígado, jejuno, vesícula biliar, ducto biliar comum, tecido adiposo branco e tecido muscular esquelético), genes implicados na homeostase de glicose e lipídios, níveis de FGF19 na bile, intestino microbiota, coceira colestática e composição de sais biliares na urina.

Natureza e extensão da carga e riscos associados à participação, benefício e parentesco com o grupo: Os pacientes planejados para um procedimento de Whipple ou ressecção hepática estão incluídos. O consentimento informado será obtido no ambulatório ou no dia da internação, com prazo de uma semana para decisão. Os pacientes também terão tempo para fazer perguntas.

O sangue desses pacientes será coletado durante a cirurgia sob anestesia geral da veia porta, veia hepática, veia mesentérica superior, veia mesentérica inferior, veia esplênica, veia renal e artéria radial. A configuração experimental consiste em 1 vez de amostragem de sangue arterial (10ml) e 1 vez de amostragem de sangue intra-abdominal (6x10ml), que é um máximo de 70 ml no total. Durante a cirurgia, o fluxo sanguíneo será medido da veia porta e da artéria hepática para calcular com precisão os fluxos dos órgãos. A veia porta e a artéria hepática são de fácil acesso para medição de fluxo com o medidor de fluxo Transonic. Este dispositivo tem certificação CE e é usado rotineiramente para medir o fluxo sanguíneo real. Nenhum risco está associado à medição desses fluxos sanguíneos.

Além disso, serão coletadas amostras de bile durante a cirurgia (4 ml) da vesícula biliar ou do ducto hepático durante a cirurgia, e biópsias serão feitas do fígado (1, no caso de ressecção hepática), vesícula biliar (1), jejuno (1, no caso de hepatojejunostomia), ducto biliar comum (CBD, 1). tecido adiposo branco (WAT, de três sítios; tecido adiposo subcutâneo, omental e visceral) e músculo reto abdominal para estudos de expressão gênica de genes. Além disso, fezes e urina perioperatórias e conteúdo jejunal durante a cirurgia (no caso de hepaticojejunostomia) serão coletados para análise detalhada da composição da microbiota/sais biliares para investigar o efeito da colestase obstrutiva sobre esses parâmetros. Os pacientes serão avaliados quanto à gravidade da coceira por um questionário (escala visual analógica e escala 5D de coceira) no dia anterior à cirurgia para correlacionar os fluxos com a coceira colestática.

Os métodos aplicados, ou seja, amostragem de sangue arterial e intra-abdominal e coleta de biópsias hepáticas/jejunais como parte da ressecção planejada, foram usados ​​anteriormente sem quaisquer consequências para os procedimentos cirúrgicos ou para os pacientes. Em comparação com protocolos éticos previamente aprovados, serão coletadas amostras de bile (4 ml) da vesícula biliar ou do ducto hepático durante a cirurgia, e biópsias da vesícula biliar (1x), CBD (1x) e WAT (3x), bem como fezes serão coletados uma vez no pré-operatório. Não há riscos adicionais relacionados à coleta de bile e tecidos, uma vez que estes fazem parte dos tecidos ressecados. A biópsia do intestino delgado, do tecido adiposo branco e do músculo reto abdominal será retirada das partes que serão ressecadas durante a cirurgia ou do local da incisão cirúrgica, evitando assim o risco de complicações permanentes. O sangramento peroperatório potencial do tecido será eletrocoagulado pelo cirurgião. As biópsias abdominais serão feitas por cirurgiões hepatopancreaticobiliares qualificados. Nenhum risco adicional está associado à coleta de fezes e urina pré-operatória. Embora os resultados deste projeto não tenham efeitos positivos diretos para os pacientes envolvidos, eles contribuem para a compreensão do papel dos sais biliares e da sinalização do FGF19 em condições colestáticas. Os insights deste estudo forneceriam novidade e conhecimento substancial sobre os possíveis efeitos da terapia com FGF19 na lesão hepática colestática.