FGF19 en colestasis obstructiva: "Revelar la señal" (FOCUS)

Debido a que las sales biliares son emulsionantes biológicos, juegan un papel esencial en la digestión y absorción de los lípidos de la dieta y las vitaminas liposolubles. Las sales biliares también actúan como potentes moléculas de señalización que se dirigen a los receptores unidos a la membrana de las células plasmáticas y nucleares que detectan las sales biliares. Varios procesos metabólicos y biológicos están influenciados por la activación de estos receptores, incluyendo la homeostasis de las sales biliares y la glucosa, la termogénesis, la función de barrera intestinal y la regeneración del hígado.

Las sales biliares se sintetizan en el hígado y se devuelven eficientemente al hígado a través de la luz intestinal y la sangre portal (circulación enterohepática = EHC). El contenido de sales biliares hepáticas está estrictamente regulado en múltiples niveles para mantener niveles no tóxicos. El factor de transcripción Farnesoid X Receptor (FXR) juega un papel clave en la homeostasis de las sales biliares al regular la síntesis, la excreción biliar, la recaptación intestinal y el metabolismo de las sales biliares. La deficiencia genética de FXR en ratones da como resultado una función de barrera intestinal alterada, un metabolismo hepático desregulado y una recuperación alterada de la lesión hepática colestática. Las sales biliares reprimen su propia biosíntesis, y esto abarca la activación de FXR por sales biliares en el tejido enterohepático y el control de la transcripción de Cyp7a1 en el hígado (enzima limitante de la velocidad de síntesis de sales biliares). El FXR hepático activado reprime la enzima sintética de sales biliares Cyp7a1 al inducir la expresión de Shp. Por otro lado, el FXR activado en el íleon induce la expresión de FGF19, que envía señales al hígado para reprimir la expresión de Cyp7a1. Se considera que el hígado es el objetivo principal de FGF19, ya que expresa ambos componentes del complejo receptor de FGF19 (FGFR4-βklotho). Los experimentos con animales demostraron un papel crucial del FXR intestinal en la prevención del crecimiento excesivo de bacterias y el mantenimiento de la integridad intestinal en un modelo de colestasis obstructiva en ratones. Además, la activación intestinal de FXR mejoró la lesión hepática colestásica en ratones ligados a conductos biliares. Esto enfatiza que un EHC intacto es crucial para mantener la homeostasis del tejido en el intestino delgado y el hígado.

En pacientes con colestasis obstructiva (p. ej., cáncer de páncreas y colangiocarcinoma). La ausencia de bilis en el tracto intestinal se asocia con estas anomalías. Los investigadores postulan que el flujo normal de bilis en pacientes con colestasis obstructiva se ve afectado y, por lo tanto, se altera la señalización de las sales biliares, lo que conduce a una desregulación en los tejidos enterohepáticos. Para mejorar aún más nuestra comprensión de la señalización de las sales biliares-FGF19 en diferentes órganos abdominales, los investigadores obtendrán muestras de sangre no solo de la arteria radial, la vena porta y la vena hepática, sino también de la vena mesentérica superior, la vena mesentérica inferior, la vena esplénica vena y la vena renal. Al incluir estos vasos sanguíneos, los investigadores podrán obtener información sobre la contribución del intestino delgado, el colon, el bazo y los riñones, por separado, en la producción o extracción de FGF19 en humanos. Es decir, las diferencias arteriovenosas (ΔAV) y los flujos netos de órganos (flujo x ΔAV) sirven como una medida cuantitativa del intercambio de metabolitos a través de las vísceras drenadas por el portal (PDV), el área esplácnica y el intestino delgado, el colon, el bazo y los riñones.

La hipótesis es que el flujo entre órganos de FGF19 cambia durante la colestasis obstructiva hacia la producción o liberación de FGF19 por otros órganos abdominales en lugar del intestino delgado. La elevación de FGF19 en suero y la expresión de ARNm de FGF19 en el hígado de pacientes con colestasis obstructiva respaldan este concepto.

El objetivo de este estudio es investigar la señalización de FGF19 en pacientes con colestasis en comparación con pacientes no colestásicos mediante el cálculo de flujos a través de los órganos drenados del portal. En segundo lugar, los investigadores investigarán las consecuencias metabólicas y funcionales (glucosa, homeostasis de lípidos, picor colestásico, función de barrera intestinal, composición de sales biliares) de una vía alterada de FXR-FGF19 en humanos. Los hallazgos de este estudio proporcionarán nuevos conocimientos sobre la señalización de la sal biliar enterohepática-FGF19 en humanos y pueden conducir a posibles estrategias terapéuticas en enfermedades hepáticas colestásicas.

Objetivo primario

• Determinar los flujos interorgánicos in vivo de FGF19 en pacientes con colestasis obstructiva en comparación con pacientes no colestásicos y pacientes drenados

Objetivos secundarios

• Determinar los flujos orgánicos de sales biliares (especies) en pacientes con colestasis obstructiva en comparación con pacientes no colestásicos (grupo de control) y pacientes drenados (grupo EHC restaurado)
• Determinar la expresión génica de genes implicados en la señalización de sales biliares y FGF19 en tejidos enterohepáticos (hígado, yeyuno, vesícula biliar, colédoco, tejido adiposo blanco) y tejido muscular esquelético de pacientes con colestasis obstructiva en comparación con pacientes no colestásicos (grupo de control) y pacientes drenados (grupo EHC restaurado).
• Determinar la microbiota de pacientes con colestasis obstructiva en comparación con pacientes no colestásicos (grupo control) y pacientes drenados (grupo EHC restaurado) en heces preoperatorias y contenido fecal intraluminal intraoperatorio.
• Determinar la composición de sales biliares en pacientes con pacientes no colestásicos (grupo control) y pacientes drenados (grupo EHC restaurado) en plasma, orina y bilis.
• Determine si los flujos de metabolitos (p. sales biliares, FGF19) están relacionados con el prurito colestásico

De los pacientes participantes en el estudio se recolectará i) sangre, ii) tejido de material resecado, iii) bilis, iv) heces, v) orina, vi) contenido yeyunal y vii) información sobre la severidad del prurito. Dado que los vasos sanguíneos que se indican a continuación son fácilmente accesibles en pacientes sometidos a pancreaticoduodenectomía con preservación del píloro (pp Whipple) o resección hepática, estos pacientes son elegibles para el estudio y serán incluidos. Antes del muestreo de sangre, el flujo sanguíneo de la vena porta y la arteria hepática se medirá inmediatamente con el medidor de flujo sanguíneo Transonic. Se tomarán muestras de sangre de los siguientes vasos:

vena porta, vena hepática, vena mesentérica superior, vena mesentérica inferior, vena esplénica, vena renal, arteria radial

Las diferencias arteriovenosas (ΔAV) y los flujos netos de órganos (flujo x ΔAV) son una medida cuantitativa del papel del hígado, el PDV, el área esplácnica, el intestino delgado, el colon, el bazo y los riñones en la producción o extracción de FGF19 y sales biliares. Los flujos se calcularán midiendo los niveles plasmáticos de metabolitos y determinando el flujo sanguíneo en estos vasos.

Todos los pacientes que se someten a una resección de Whipple o hepática tienen un catéter arterial durante la cirugía del que los investigadores pueden extraer muestras de sangre. Las venas mencionadas (6x) se puncionarán directamente con agujas de 25G. Se tomarán muestras de 10 ml de sangre arterial y 10 ml de sangre intraabdominal de los diferentes vasos por separado una vez durante la cirugía, lo que da como resultado una cantidad total de sangre muestreada de un máximo de 70 ml. Todas las muestras de sangre se recogerán en tubos de vacío con EDTA preenfriados y heparinizados y se centrifugarán a 3500 rpm a 4 °C durante 10 minutos. El plasma se almacenará en vasos Eppendorf a -80 °C hasta su posterior análisis. El flujo sanguíneo se medirá mediante ultrasonografía dúplex intraoperatoria.

Los tejidos se explorarán mediante histología (histoquímica, inmunohistoquímica/fluorescente) y para un análisis detallado de los genes implicados en la señalización de las sales biliares-FGF19 y los procesos metabólicos (p. homeostasis de glucosa, homeostasis de lípidos). Se recolectarán los siguientes tejidos (del material resecado) durante la cirugía, lo que permitirá un estudio detallado de los genes implicados en la señalización de las sales biliares-FGF19 en los tejidos enterohepáticos:

muestra de hígado (en caso de resección hepática), muestra de vesícula biliar, muestra de conducto biliar común, muestra de yeyuno proximal (en caso de hepaticoyeyunostomía durante el procedimiento quirúrgico), tejido adiposo blanco (WAT) [subcutáneo, omental, visceral], músculo recto abdominal

Un estudio anterior mostró que la bilis humana contiene altos niveles de FGF19. Sin embargo, se desconoce el papel funcional exacto de FGF19 en la bilis. Por lo tanto, la bilis se recolectará intraoperatoriamente para investigar el efecto de la colestasis obstructiva en los niveles de FGF19 en la bilis. La bilis se recogerá por punción de la vesícula biliar después de la extracción o del conducto biliar hepático en caso de que la vesícula no esté in situ.

La microbiota intestinal juega un papel importante en la homeostasis de las sales biliares mediante la modificación secundaria y la desconjugación de las sales biliares primarias. La composición microbiana (p. Se analizará el cambio en las bacterias productoras de hidrolasa de sales biliares) de las heces preoperatorias y el contenido yeyunal proximal durante la cirugía. El plasma de los tres grupos de pacientes (control, drenado y colestásico) se analizará en busca de marcadores de la función de los enterocitos (p. citrulina) y daño de enterocitos (p. IFABP), daño transmural (SM22), endotoxinas (LBP), citocinas proinflamatorias (IL-6 y TNF-alfa) y nuevos marcadores de inflamación hepática (catepsina).

El prurito colestásico (picazón) es común en pacientes con colestasis obstructiva. Actualmente se desconoce el origen del prurito y las sales biliares están implicadas en el desarrollo del prurito colestásico. Por lo tanto, a los investigadores les gustaría pedirles a los pacientes que califiquen la intensidad de la picazón el día anterior a la cirugía mediante una escala analógica visual (VAS, una escala de 0 (sin picazón) a 10 (peor picazón posible)). Además, los investigadores les pedirán que rellenen un breve cuestionario, la escala de picor 5D. Metabolitos implicados en el picor (p. sales biliares) se analizarán en las muestras de sangre para calcular los flujos y estos se correlacionarán con las puntuaciones VAS preoperatorias y la escala de picor 5D.

También se recolectará la orina antes de la operación de todos los pacientes para investigar si la colestasis influye en la ruta de excreción de sales biliares (de la excreción biliar a la excreción renal). La composición de sales biliares se analizará en la orina con espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS).

Principales parámetros/criterios de valoración del estudio: El principal parámetro del estudio es el flujo orgánico neto de FGF19 a través de los órganos abdominales calculado midiendo los niveles de FGF19 en plasma humano utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en pacientes colestásicos versus no colestásicos y pacientes drenados . El plasma humano se obtendrá durante la cirugía de 7 vasos i) arteria radial, ii) vena mesentérica superior, iii) vena mesentérica inferior, iv) vena renal, v) vena esplénica, vi) vena hepática y vii) vena porta para calcular el órgano neto flujos Los parámetros secundarios son la expresión de genes relacionados con la señalización de sales biliares y FGF19 en tejidos enterohepáticos (hígado, yeyuno, vesícula biliar, conducto biliar común, tejido adiposo blanco y tejido muscular esquelético), genes implicados en la homeostasis de glucosa y lípidos, niveles de FGF19 en bilis, intestino microbiota, picor colestásico y composición de sales biliares en orina.

Naturaleza y alcance de la carga y los riesgos asociados con la participación, el beneficio y la relación con el grupo: se incluyen los pacientes planificados para un procedimiento de Whipple o una resección hepática. El consentimiento informado se obtendrá en la sala de consulta externa o el día del ingreso, con una semana de plazo para decidir. Los pacientes también tendrán tiempo para hacer preguntas.

Se tomarán muestras de sangre de estos pacientes durante la cirugía bajo anestesia general de la vena porta, la vena hepática, la vena mesentérica superior, la vena mesentérica inferior, la vena esplénica, la vena renal y la arteria radial. La configuración experimental consiste en una muestra de sangre arterial 1 vez (10 ml) y una muestra de sangre intraabdominal 1 vez (6x10 ml), que es un máximo de 70 ml en total. Durante la cirugía, se medirá el flujo sanguíneo de la vena porta y la arteria hepática para calcular con precisión los flujos de órganos. La vena porta y la arteria hepática son fácilmente accesibles para medir el flujo con el medidor de flujo Transonic. Este dispositivo tiene certificación CE y se usa de forma rutinaria para medir el flujo sanguíneo real. No hay riesgos asociados con la medición de estos flujos sanguíneos.

Además, se tomarán muestras de bilis durante la cirugía (4 ml) de la vesícula biliar o conducto hepático durante la cirugía, y se tomarán biopsias de hígado (1, en caso de resección hepática), vesícula biliar (1), yeyuno (1, en caso de de hepaticoyeyunostomía), colédoco (CBD, 1). tejido adiposo blanco (WAT, de tres sitios; tejido adiposo subcutáneo, omental y visceral) y músculo recto abdominal para estudios de expresión génica de genes. Además, se recolectarán heces y orina perioperatorias y contenido yeyunal durante la cirugía (en caso de hepaticoyeyunostomía) para un análisis detallado de la composición de microbiota/sales biliares para investigar el efecto de la colestasis obstructiva en estos parámetros. Se evaluará a los pacientes en cuanto a la gravedad del picor mediante un cuestionario (escala analógica visual y escala de picor 5D) el día antes de la cirugía para correlacionar los flujos con el picor colestásico.

Los métodos aplicados, es decir, la toma de muestras de sangre arterial e intraabdominal y la obtención de biopsias hepáticas/yeyunales como parte de la resección planificada, se han utilizado previamente sin ninguna consecuencia para los procedimientos quirúrgicos o los pacientes. En comparación con los protocolos previamente aprobados por ética, se tomarán muestras de bilis (4 ml) de la vesícula biliar o del conducto hepático durante la cirugía, y se realizarán biopsias de la vesícula biliar (1x), CBD (1x) y WAT (3x), así como heces. recogido una vez antes de la operación. No existen riesgos adicionales relacionados con la recolección de bilis y tejidos ya que estos son parte de los tejidos resecados. La biopsia de intestino delgado, tejido adiposo blanco y músculo recto abdominal se tomará de las partes que serán resecadas durante la cirugía o del sitio de la incisión quirúrgica, evitando así el riesgo de complicaciones permanentes. El cirujano electrocoagulará el posible sangrado perioperatorio del tejido. Las biopsias abdominales serán tomadas por cirujanos hepatopancreaticobiliares expertos. No se asocia ningún riesgo adicional con la recolección de heces y orina preoperatorias. Aunque los resultados de este proyecto no tienen efectos positivos directos para los pacientes involucrados, sí contribuyen a la comprensión del papel de las sales biliares y la señalización de FGF19 en condiciones colestásicas. Los conocimientos de este estudio proporcionarían una novedad y un conocimiento sustancial de los posibles efectos de la terapia con FGF19 en la lesión hepática colestásica.