FGF19 obstruktiivisessa kolestaasissa: "Paljasta signaali" (FOCUS)

Koska sappisuolat ovat biologisia emulgointiaineita, niillä on olennainen rooli ruoansulatuksessa ja ravinnon lipidien ja rasvaliukoisten vitamiinien imeytymisessä. Sappisuolat toimivat myös tehokkaina signaalimolekyyleina, jotka kohdistuvat sappisuolan tunnistaviin tuma- ja plasmasolukalvoon sitoutuneisiin reseptoreihin. Näiden reseptorien aktivaatio vaikuttaa useisiin metabolisiin ja biologisiin prosesseihin, mukaan lukien sappisuolan ja glukoosin homeostaasi, termogeneesi, suoliston estetoiminto ja maksan regeneraatio.

Sappisuolat syntetisoituvat maksassa ja palautuvat tehokkaasti maksaan suolen luumenin ja portaaliveren kautta (enterohepaattinen verenkierto = EHC). Maksan sappisuolapitoisuutta säännellään tiukasti useilla tasoilla myrkyttömän tason ylläpitämiseksi. Transkriptiotekijä Farnesoid X -reseptorilla (FXR) on keskeinen rooli sappisuolojen homeostaasissa säätelemällä sappisuolojen synteesiä, sappieritystä, takaisinottoa suolistosta ja aineenvaihduntaa. FXR:n geneettinen puutos hiirillä johtaa heikentyneeseen suoliston estetoimintoon, säätelemättömään maksan aineenvaihduntaan ja heikentyneeseen toipumiseen kolestaattisesta maksavauriosta. Sappisuolat tukahduttavat omaa biosynteesiä, ja tämä kattaa FXR:n aktivoinnin sappisuoloilla enterohepaattisessa kudoksessa ja Cyp7a1:n transkription säätelyn maksassa (sappisuolan synteesin nopeutta rajoittava entsyymi). Aktivoitu maksan FXR repressoi sappisuolan synteettistä entsyymiä Cyp7a1 indusoimalla Shp:n ilmentymistä. Toisaalta aktivoitunut FXR sykkyräsuolessa indusoi FGF19:n ilmentymisen, joka antaa signaalin maksaan tukahduttamaan Cyp7a1:n ilmentymisen. Maksaa pidetään FGF19:n ensisijaisena kohteena, koska se ilmentää FGF19-reseptorikompleksin (FGFR4-βklotho) molempia komponentteja. Eläinkokeet osoittivat suoliston FXR:n ratkaisevan roolin bakteerien liikakasvun estämisessä ja suoliston eheyden ylläpitämisessä obstruktiivisen kolestaasin hiirimallissa. Lisäksi suoliston FXR-aktivaatio paransi kolestaattista maksavauriota sappitiehyissä ligoiduissa hiirissä. Tämä korostaa, että ehjä EHC on ratkaisevan tärkeä kudosten homeostaasin ylläpitämiseksi ohutsuolessa ja maksassa.

Intraluminaalista bakteerikasvua, mikrobien endotoksiinien siirtymistä, lisääntynyttä suolen läpäisevyyttä, suoliston ja maksan tulehduskaskadien aktivoitumista ja endotoksemiaa esiintyy usein potilailla, joilla on obstruktiivinen kolestaasi (esim. haimasyöpä ja kolangiokarsinooma). Näihin poikkeamiin liittyy sapen puuttuminen suolistossa. Tutkijat olettavat, että normaali sapen virtaus potilailla, joilla on obstruktiivinen kolestaasi, on heikentynyt ja siksi sappisuolasignaali on heikentynyt, mikä johtaa häiriöihin enterohepaattisissa kudoksissa. Parantaakseen ymmärrystämme sappisuola-FGF19-signaloinnin eri vatsaelinten kautta tutkijat ottavat verinäytteitä ei vain säteittäisestä valtimosta, portaalista ja maksalaskimosta, vaan myös suoliliepeen ylälaskimosta, suoliliepeen alemmasta laskimosta ja pernasta. laskimo ja munuaislaskimo. Kun nämä verisuonet otetaan mukaan, tutkijat voivat saada tietoa ohutsuolen, paksusuolen, pernan ja munuaisten osuudesta erikseen FGF19:n tuotannossa tai uuttamisessa ihmisillä. Nimittäin arteriovenoosierot (ΔAV) ja elinten nettovirtaukset (virtaus x ΔAV) toimivat kvantitatiivisena mittana metaboliitin vaihdolle portaalin tyhjentyneen sisäelimen (PDV), splanchnisen alueen ja ohutsuolen, paksusuolen, pernan ja munuaisten läpi.

Hypoteesi on, että FGF19-elinten välinen virtaus siirtyy obstruktiivisen kolestaasin aikana FGF19:n tuotantoon tai vapautumiseen muissa vatsan elimissä ohutsuolen sijaan. Seerumin FGF19:n nousu ja FGF19-mRNA:n ilmentyminen obstruktiivista kolestaasipotilaiden maksassa tukevat tätä käsitettä.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia FGF19-signalointia kolestaasipotilailla verrattuna ei-kolestaattisiin potilaisiin laskemalla virtaukset portaalin tyhjennettyjen elinten poikki. Toiseksi tutkijat tutkivat häiriintyneen FXR-FGF19-reitin metabolisia ja toiminnallisia seurauksia (glukoosi, lipidien homeostaasi, kolestaattinen kutina, suoliston estetoiminto, sappisuolan koostumus). Tämän tutkimuksen havainnot antavat uusia näkemyksiä enterohepaattisen sappisuola-FGF19-signalointiin ihmisillä ja voivat johtaa mahdollisiin hoitostrategioihin kolestaattisissa maksasairaudissa.

Ensisijainen tavoite

• Määritä FGF19:n elinten väliset in vivo -virrat potilailla, joilla on obstruktiivista kolestaasi, verrattuna potilaisiin, joilla ei ole kolestaattista sairautta ja jotka ovat poistuneet

Toissijaiset tavoitteet

• Selvitä sappisuolojen (lajit) elinten virrat potilailla, joilla on obstruktiivinen kolestaasi verrattuna ei-kolestaattisiin potilaisiin (kontrolliryhmä) ja tyhjennetyihin potilaisiin (palautettu EHC-ryhmä)
• Määritä sappisuolan ja FGF19-signalointiin liittyvien geenien geeniekspressio enterohepaattisissa kudoksissa (maksa, jejunum, sappirakko, yhteinen sappitie, valkoiset rasvakudokset) ja luurankolihaskudoksessa potilailla, joilla on obstruktiivinen kolestaasi verrattuna ei-kolestaattisiin potilaisiin (kontrolliryhmä) ja kuivatut potilaat (palautettu EHC-ryhmä).
• Selvitä obstruktiivista kolestaasipotilaiden mikrobiota verrattuna ei-kolestaattisiin potilaisiin (kontrolliryhmä) ja tyhjennetyihin potilaisiin (palautettu EHC-ryhmä) preoperatiivisessa ulosteessa ja intraluminaalisessa ulosteessa.
• Määritä sappisuolakoostumus potilailla, joilla on ei-kolestaattisia potilaita (kontrolliryhmä) ja tyhjennettyjä potilaita (palautettu EHC-ryhmä) plasmassa, virtsassa ja sapessa.
• Selvitä, ovatko metaboliittien virrat (esim. sappisuolat, FGF19) liittyvät kolestaattiseen kutinaan

Tutkimukseen osallistuneilta potilailta kerätään i) veri, ii) kudos resektoidusta materiaalista, iii) sappi, iv) uloste, v) virtsa, vi) jejunaalsisältö ja vii) tiedot kutinan vaikeusasteesta. Koska alla mainitut verisuonet ovat helposti saavutettavissa potilailla, joille tehdään pylorusta säilyttävä haima-duodenektomia (pp Whipple) tai maksaresektio, nämä potilaat ovat kelvollisia tutkimukseen ja otetaan mukaan. Ennen verinäytteenottoa porttilaskimon ja maksavaltimon verenvirtaus mitataan välittömästi Transonic-verenvirtausmittarilla. Verinäyte otetaan seuraavista suonista:

porttilaskimo, maksalaskimo, ylempi suoliliepeen laskimo, suoliliepeen alalaskimo, pernalaskimo, munuaislaskimo, säteittäinen valtimo

Valtimolaskimoerot (ΔAV) ja elinten nettovirtaukset (virtaus x ΔAV) ovat kvantitatiivinen mitta maksan, PDV:n, splanchnisen alueen, ohutsuolen, paksusuolen, pernan ja munuaisten roolista FGF19:n ja sappisuolojen tuottamisessa tai uuttamisessa. Virtaukset lasketaan mittaamalla aineenvaihduntatuotteiden tasot plasmassa ja määrittämällä veren virtaus näissä suonissa.

Kaikilla potilailla, joille tehdään pp Whipple- tai maksaresektio, on leikkauksen aikana valtimokatetri, josta tutkijat voivat ottaa verinäytteitä. Mainitut suonet (6x) puhkaistaan ​​suoraan 25G neuloilla. 10 ml valtimoverta ja 10 ml vatsansisäistä verta eri verisuonista otetaan erikseen kerran leikkauksen aikana, jolloin näytteen kokonaismäärä on enintään 70 ml. Kaikki verinäytteet kerätään sekä esijäähdytettyihin EDTA- että heparinisoituihin tyhjiöputkiin ja sentrifugoidaan nopeudella 3500 rpm 4 °C:ssa 10 minuuttia. Plasmaa säilytetään Eppendorf-kupeissa -80 °C:ssa lisäanalyysiin asti. Verenvirtaus mitataan intraoperatiivisella Duplex-ultraäänellä.

Kudoksia tutkitaan histologialla (histokemia, immunohistokemia/fluoresoiva) ja sappisuolan FGF19-signalointiin ja aineenvaihduntaprosesseihin liittyvien geenien yksityiskohtaista analyysiä varten (esim. glukoosin homeostaasi, lipidien homeostaasi). Seuraavat kudokset (resektoidusta materiaalista) kerätään leikkauksen aikana, mikä mahdollistaa enterohepaattisten kudosten sappisuola-FGF19-signalointiin liittyvien geenien yksityiskohtaisen tutkimuksen:

maksanäyte (maksan resektiossa), sappirakkonäyte, yhteisen sappitiehyen näyte, proksimaalinen jejunaalnäyte (hepaticojejunostomian tapauksessa kirurgisen toimenpiteen aikana), valkoinen rasvakudos (WAT) [ihonalainen, omentaalinen, viskeraalinen], vatsasuora lihas

Aiempi tutkimus osoitti, että ihmisen sappi sisältää suuria määriä FGF19:ää. FGF19:n tarkkaa toiminnallista roolia sapessa ei kuitenkaan tunneta. Siksi sappi kerätään leikkauksen aikana, jotta voidaan tutkia obstruktiivisen kolestaasin vaikutusta sapen FGF19-tasoihin. Sappi kerätään puhkaisemalla sappirakon poistamisen jälkeen tai maksan sappitiehyestä, jos sappirakko ei ole paikalla.

Suoliston mikrobiotalla on tärkeä rooli sappisuolojen homeostaasissa primaaristen sappisuolojen sekundaarisen modifioinnin ja dekonjugoinnin kautta. Mikrobikoostumus (esim. sappisuolan hydrolaasia tuottavien bakteerien muutos ennen leikkausta ulosteessa ja proksimaalisessa jejunaalisessa sisällössä leikkauksen aikana analysoidaan. Kolmen potilasryhmän (verrokki, tyhjennetty ja kolestaattinen) plasmasta analysoidaan enterosyyttien toiminnan merkkiaineet (esim. sitrulliini) ja enterosyyttivauriot (esim. IFABP, transmuraalinen vaurio (SM22), endotoksiinit (LBP), tulehdusta edistävät sytokiinit (IL-6 ja TNF-alfa) ja uudet maksatulehdusmarkkerit (katepsiini).

Kolestaattinen kutina (kutina) on yleistä potilailla, joilla on obstruktiivinen kolestaasi. Kutinan lähde on tällä hetkellä tuntematon, ja sappisuolat ovat osallisena kolestaattisen kutinan kehittymisessä. Siksi tutkijat haluaisivat pyytää potilaita arvioimaan kutinansa voimakkuuden leikkausta edeltävänä päivänä Visual Analogue Scale -asteikolla (VAS, asteikko 0 (ei kutinaa) 10:een (pahin mahdollinen kutina)). Lisäksi tutkijat pyytävät heitä täyttämään lyhyen kyselylomakkeen, 5D-kutina-asteikon. Kutinaan liittyvät aineenvaihduntatuotteet (esim. sappisuolat) analysoidaan verinäytteistä virtausten laskemiseksi, ja ne korreloidaan ennen leikkausta saatujen VAS-pisteiden ja 5D-kutina-asteikon kanssa.

Virtsa kerätään myös ennen leikkausta kaikilta potilailta sen tutkimiseksi, vaikuttaako kolestaasi sappisuolan erittymiseen (sappien erittymisestä munuaisten kautta). Sappisuolakoostumus analysoidaan virtsasta nestekromatografisella massaspektrometrialla (LC-MS).

Tärkeimmät tutkimusparametrit/päätepisteet: Päätutkimusparametri on FGF19:n nettoelinvirta vatsaelinten välillä, joka on laskettu mittaamalla FGF19-tasot ihmisen plasmassa käyttämällä entsyymikytkentäistä immunosorbenttimääritystä (ELISA) kolestaattisilla potilailla verrattuna ei-kolestaattisilla potilailla ja poistetuilla potilailla. . Ihmisen plasma otetaan leikkauksen aikana 7 verisuonesta i) säteittäinen valtimo, ii) suoliliepeen ylälaskimo, iii) suoliliepeen alalaskimo, iv) munuaislaskimo, v) pernalaskimo, vi) maksalaskimo ja vii) porttilaskimo verkkoelimen laskemiseksi vuoteet. Toissijaisia ​​parametreja ovat sappisuolaan ja FGF19-signalointiin liittyvien geenien ilmentyminen enterohepaattisissa kudoksissa (maksa, jejunum, sappirakko, yhteinen sappitiehy, valkoinen rasvakudos ja luustolihaskudos), glukoosin ja lipidien homeostaasiin liittyvät geenit, FGF19-tasot sapessa, suolistossa mikrobiota, kolestaattinen kutina ja sappisuolakoostumus virtsassa.

Osallistumiseen, hyötyyn ja ryhmiin liittyvien taakan ja riskien luonne ja laajuus: Potilaat, jotka on suunniteltu Whipple-toimenpiteeseen tai maksaresektioon, ovat mukana. Tietoinen suostumus saadaan joko poliklinikalla tai vastaanottopäivänä, jolloin päätöksen tekemiseen on viikko. Potilailla on myös aikaa esittää kysymyksiä.

Näiltä potilailta otetaan verinäyte leikkauksen aikana yleisanestesiassa porttilaskimosta, maksalaskimosta, suoliliepeen ylälaskimosta, suoliliepeen alemmasta laskimosta, pernalaskimosta, munuaislaskimosta ja säteen valtimosta. Kokeellinen järjestely koostuu 1 kerran valtimoverinäytteestä (10 ml) ja 1 kerran vatsansisäisestä verinäytteestä (6 x 10 ml), joka on yhteensä enintään 70 ml. Leikkauksen aikana verenvirtausta mitataan porttilaskimosta ja maksavaltimosta elinten virtausten laskemiseksi tarkasti. Porttilaskimoon ja maksavaltimoon pääsee helposti käsiksi virtauksen mittausta varten Transonic-virtausmittarilla. Tämä laite on CE-sertifioitu ja sitä käytetään rutiininomaisesti todellisen verenkierron mittaamiseen. Näiden verenvirtausten mittaamiseen ei liity riskejä.

Lisäksi leikkauksen aikana otetaan sappinäyte (4 ml) sappirakosta tai maksatiehyestä leikkauksen aikana ja biopsiat maksasta (1, jos maksaresektio), sappirakosta (1), jejunumista (1, jos hepaticojejunostomia), yhteinen sappitiehy (CBD, 1). valkoinen rasvakudos (WAT, kolmesta paikasta; ihonalainen, omentaalinen ja viskeraalinen rasvakudos) ja vatsasuora lihas geenien geeniekspressiotutkimuksiin. Lisäksi perioperatiiviset ulosteet ja virtsa sekä jejunaalin sisältö leikkauksen aikana (hepaticojejunostomian tapauksessa) kerätään mikrobiota/sappisuolan koostumuksen yksityiskohtaista analysointia varten, jotta voidaan tutkia obstruktiivisen kolestaasin vaikutusta näihin parametreihin. Potilaiden kutinan vakavuus arvioidaan kyselylomakkeella (visuaalinen analoginen asteikko ja 5D-kutinaasteikko) leikkausta edeltävänä päivänä, jotta voidaan korreloida virtaukset kolestaattiseen kutinaan.

Käytettyjä menetelmiä eli valtimon ja vatsansisäisen veren näytteenottoa ja maksa/jejunaalbiopsioiden keräämistä osana suunniteltua resektiota on käytetty aiemmin ilman, että sillä ole seurauksia kirurgisille toimenpiteille tai potilaille. Verrattuna aikaisempiin eettisiin hyväksyttyihin protokolliin, sappiraosta tai maksatiehyestä otetaan leikkauksen aikana näyte (4 ml) ja biopsiat sappirakosta (1x), CBD (1x) ja WAT ​​(3x) sekä ulosteesta. kerätty kerran ennen leikkausta. Sappien ja kudosten keräämiseen ei liity lisäriskejä, koska nämä ovat osa resektoituja kudoksia. Ohutsuolen, valkoisen rasvakudoksen ja suoran vatsalihaksen biopsia otetaan osista, jotka leikataan leikkauksen aikana tai leikkausviillosta, mikä estää pysyvien komplikaatioiden riskin. Kirurgi elektroaguloi kudoksen mahdollisen peroperatiivisen verenvuodon. Ammattitaitoiset hepatopankreaticobiliaarikirurgit ottavat vatsan biopsiat. Preoperatiivisten ulosteiden ja virtsan keräämiseen ei liity muita riskejä. Vaikka tämän projektin tuloksilla ei ole suoria positiivisia vaikutuksia mukana oleviin potilaisiin, ne auttavat ymmärtämään sappisuolojen ja FGF19-signaloinnin roolia kolestaattisissa olosuhteissa. Tästä tutkimuksesta saadut oivallukset tarjoaisivat uutta ja merkittävää tietoa FGF19-hoidon mahdollisista vaikutuksista kolestaattiseen maksavaurioon.