FGF19 i obstruktiv kolestase: "Unveil the Signal" (FOCUS)

Fordi galdesalte er biologiske emulgatorer, spiller de en væsentlig rolle i fordøjelsen og absorptionen af ​​kostens lipider og fedtopløselige vitaminer. Galdesalte fungerer også som potente signalmolekyler, der målretter galdesalt-følende nuklear- og plasmacellemembranbundne receptorer. Adskillige metaboliske og biologiske processer påvirkes af aktivering af disse receptorer, herunder galdesalt og glucosehomeostase, termogenese, tarmbarrierefunktion og leverregenerering.

Galdesalte syntetiseres i leveren og returneres effektivt til leveren via tarmlumen og portalblod (enterohepatisk cirkulation = EHC). Indholdet af galdesalt i leveren er stramt reguleret på flere niveauer for at opretholde ikke-toksiske niveauer. Transkriptionsfaktoren Farnesoid X Receptor (FXR) spiller en nøglerolle i galdesalthomeostase ved at regulere syntese, galdeudskillelse, intestinal genoptagelse og metabolisme af galdesalte. Genetisk mangel på FXR hos mus resulterer i nedsat tarmbarrierefunktion, dysreguleret levermetabolisme og nedsat restitution fra kolestatisk leverskade. Galdesalte undertrykker deres egen biosyntese, og dette omfatter aktivering af FXR af galdesalte i det enterohepatiske væv og styring af transskriptionen af ​​Cyp7a1 i leveren (hastighedsbegrænsende enzym for galdesaltsyntese). Aktiveret hepatisk FXR undertrykker det syntetiske galdesalt enzym Cyp7a1 ved at inducere ekspressionen af ​​Shp. På den anden side inducerer aktiveret FXR i ileum ekspressionen af ​​FGF19, som signalerer til leveren om at undertrykke ekspressionen af ​​Cyp7a1. Leveren anses for at være det primære mål for FGF19, da den udtrykker begge komponenter i FGF19-receptorkomplekset (FGFR4-βklotho). Dyreforsøg viste en afgørende rolle for intestinal FXR i forebyggelse af bakteriel overvækst og opretholdelse af tarmintegritet i en musemodel af obstruktiv kolestase. Desuden forbedrede intestinal FXR-aktivering kolestatisk leverskade hos galdegang-ligerede mus. Dette understreger, at en intakt EHC er afgørende for at opretholde vævshomeostase i tyndtarmen og leveren.

Intraluminal bakteriel overvækst, translokation af mikrobielle endotoksiner, øget intestinal permeabilitet, aktivering af intestinale og hepatiske inflammatoriske kaskader og endotoksæmi forekommer hyppigt hos patienter med obstruktiv kolestase (f. bugspytkirtelkræft og kolangiocarcinom). Fravær af galde i tarmkanalen er forbundet med disse anomalier. Forskerne postulerer, at normal galdestrøm hos patienter med obstruktiv kolestase er svækket, og galdesaltsignalering er derfor svækket, hvilket fører til dysregulering i enterohepatisk væv. For yderligere at forbedre vores forståelse af galdesalt-FGF19-signalering på tværs af forskellige abdominale organer, vil efterforskerne indhente blodprøver ikke kun fra den radiale arterie, portalen og levervenen, men også fra den øvre mesenteriske vene, den inferior mesenteriske vene, milten. vene og nyrevenen. Ved at inkludere disse blodkar vil efterforskerne være i stand til at få information om bidraget fra tyndtarmen, tyktarmen, milten og nyrerne, separat i produktionen eller udvindingen af ​​FGF19 hos mennesker. Nemlig, arteriovenøse forskelle (ΔAV) og netto organfluxer (flow x ΔAV) tjener som et kvantitativt mål for metabolitudveksling på tværs af de portaldrænede viscera (PDV), det splanchniske område og tyndtarmen, tyktarmen, milten og nyrerne.

Hypotesen er, at FGF19 inter-organ flux skifter under obstruktiv kolestase mod produktion eller frigivelse af FGF19 af andre abdominale organer snarere end tyndtarmen. Serum-FGF19-forhøjelse og FGF19-mRNA-ekspression i leveren hos patienter med obstruktiv kolestase understøtter dette koncept.

Formålet med denne undersøgelse er at undersøge FGF19-signalering hos patienter med kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske patienter ved at beregne fluxer på tværs af de portaldrænede organer. For det andet vil efterforskerne undersøge de metaboliske og funktionelle konsekvenser (glucose, lipidhomeostase, kolestatisk kløe, tarmbarrierefunktion, galdesaltsammensætning) af en forstyrret FXR-FGF19-vej hos mennesker. Resultater fra denne undersøgelse vil give ny indsigt i enterohepatisk galdesalt-FGF19-signalering hos mennesker og kan føre til potentielle terapeutiske strategier ved kolestatiske leversygdomme.

Primært mål

• Bestem in vivo interorganfluxer af FGF19 hos patienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske patienter og drænede patienter

Sekundære mål

• Bestem organstrømme af galdesalte (arter) hos patienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske patienter (kontrolgruppe) og drænede patienter (genoprettet EHC-gruppe)
• Bestem genekspression af gener impliceret i galdesalt og FGF19-signalering i enterohepatisk væv (lever, jejunum, galdeblære, almindelig galdegang, hvidt fedtvæv) og skeletmuskelvæv fra patienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske patienter (kontrolgruppe) og drænede patienter (gendannet EHC-gruppe).
• Bestem mikrobiota af patienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske patienter (kontrolgruppe) og drænede patienter (gendannet EHC-gruppe) i præoperativ afføring og intraoperativt intraluminalt fækalt indhold.
• Bestem galdesaltsammensætning hos patienter med ikke-kolestatiske patienter (kontrolgruppe) og drænede patienter (gendannet EHC-gruppe) i plasma, urin og galde.
• Bestem, om flux af metabolitter (f.eks. galdesalte, FGF19) er relateret til kolestatisk kløe

Fra de patienter, der deltager i undersøgelsen, vil i) blod, ii) væv fra resekeret materiale, iii) galde, iv) afføring, v) urin, vi) jejunalt indhold og vii) blive indsamlet information om kløens sværhedsgrad. Da blodkarrene angivet nedenfor er let tilgængelige hos patienter, der gennemgår pylorus-bevarende pancreaticoduodenectomy (pp Whipple) eller leverresektion, er disse patienter kvalificerede til undersøgelsen og vil blive inkluderet. Før blodprøvetagning måles blodgennemstrømningen i portvenen og leverarterien umiddelbart med Transonic blodgennemstrømningsmåler. Der tages blodprøver fra følgende kar:

portvene, hepatisk vene, superior mesenteric vene, inferior mesenteric vene, miltvene, renal vene, radial arterie

Arteriovenøse forskelle (ΔAV) og netto organfluxer (flow x ΔAV) er et kvantitativt mål for leverens, PDVs, det splanchniske område, tyndtarmen, tyktarmen, miltens og nyrernes rolle i produktionen eller udvindingen af ​​FGF19 og galdesalte. Fluxerne vil blive beregnet ved at måle plasmaniveauer af metabolitter og bestemme blodgennemstrømningen i disse kar.

Alle patienter, der gennemgår pp Whipple eller leverresektion, har et arteriekateter under operationen, hvorfra efterforskerne kan tage blodprøver. De nævnte årer (6x) vil blive punkteret direkte ved hjælp af 25G nåle. Der udtages 10 ml arterielt blod og 10 ml intraabdominalt blod fra de forskellige kar separat én gang under operationen, hvilket resulterer i en samlet mængde af prøvet blod på maksimalt 70 ml. Alle blodprøver vil blive opsamlet i både forkølede EDTA og hepariniserede vakuumrør og centrifugeret ved 3500 rpm ved 4°C i 10 minutter. Plasma vil blive opbevaret i Eppendorf-kopper ved -80°C indtil videre analyse. Blodgennemstrømningen vil blive målt ved hjælp af intraoperativ duplex ultralyd.

Væv vil blive udforsket ved histologi (histokemi, immunhistokemi/fluorescerende) og til detaljeret analyse af gener impliceret i galdesalt-FGF19 signalering og metaboliske processer (f.eks. glucosehomeostase, lipidhomeostase). Følgende væv (fra resekeret materiale) under operationen vil blive indsamlet, hvilket muliggør detaljeret undersøgelse af gener impliceret i galdesalt-FGF19-signalering i enterohepatisk væv:

leverprøve (i tilfælde af leverresektion), galdeblæreprøve, almindelig galdekanalprøve, proksimal jejunal prøve (i tilfælde af hepaticojejunostomi under kirurgisk indgreb), hvidt fedtvæv (WAT) [subkutant, omentalt, visceralt], rectus abdominis muskel

Tidligere undersøgelse viste, at menneskelig galde indeholder høje niveauer af FGF19. Den nøjagtige funktionelle rolle af FGF19 i galde er imidlertid ikke kendt. Derfor vil galde blive opsamlet intraoperativt for at undersøge effekten af ​​obstruktiv kolestase på FGF19-niveauer i galde. Galde vil blive opsamlet ved punktering af galdeblæren efter fjernelse eller fra levergaldegangen, hvis galdeblæren ikke er in situ.

Tarmmikrobiotaen spiller en stor rolle i galdesalthomeostase ved sekundær modifikation og dekonjugering af primære galdesalte. Den mikrobielle sammensætning (f.eks. skift i galdesalt hydrolase-producerende bakterier) af præoperativ afføring og proksimalt jejunalt indhold under operation vil blive analyseret. Plasma fra de tre patientgrupper (kontrol, drænet og kolestatisk) vil blive analyseret for markører for enterocytfunktion (f.eks. citrullin) og enterocytskader (f.eks. IFABP), transmural skade (SM22), endotoksiner (LBP), pro-inflammatoriske cytokiner (IL-6 og TNF-alfa) og nye markører for leverbetændelse (Cathepsin).

Kolestatisk pruritis (kløe) er almindelig hos patienter med obstruktiv kolestase. Kilden til kløe er i øjeblikket ukendt, og galdesalte er impliceret i udviklingen af ​​kolestatisk kløe. Derfor vil efterforskerne gerne bede patienterne om at måle deres kløeintensitet dagen før operationen ved hjælp af en visuel analog skala (VAS, en skala fra 0 (ingen kløe) til 10 (værst mulig kløe)). Derudover vil efterforskerne bede dem om at udfylde et kort spørgeskema, 5D kløeskalaen. Metabolitter involveret i kløe (f.eks. galdesalte) vil blive analyseret i blodprøverne for at beregne fluxer, og disse vil blive korreleret med de præoperative VAS-score og 5D kløeskala.

Urin vil også blive opsamlet præoperativt fra alle patienter for at undersøge, om kolestase påvirker ruten for galdesaltudskillelse (fra galdeudskillelse til nyreudskillelse). Galdesaltsammensætning vil blive analyseret i urin med væskekromatografi massespektrometri (LC-MS).

Hovedundersøgelsesparametre/endepunkter: Hovedundersøgelsesparameteren er nettoorganstrømmen af ​​FGF19 på tværs af abdominale organer beregnet ved at måle FGF19-niveauer i humant plasma ved hjælp af en enzym-linked immuno-sorbent assay (ELISA) hos kolestatiske versus ikke-kolestatiske patienter og drænede patienter . Humant plasma vil blive opnået under kirurgi fra 7 kar i) radial arterie, ii) mesenteric superior vene, iii) mesenteric inferior vene, iv) renal vene, v) miltvene, vi) hepatisk vene og vii) portalvene for at beregne nettoorganet fluxer. Sekundære parametre er ekspression af gener relateret til galdesalt og FGF19-signalering i enterohepatisk væv (lever, jejunum, galdeblære, almindelig galdegang, hvidt fedtvæv og skeletmuskelvæv), gener impliceret i glukose- og lipidhomeostase, FGF19-niveauer i galde, tarm mikrobiota, kolestatisk kløe og galdesaltsammensætning i urin.

Arten og omfanget af byrden og risici forbundet med deltagelse, fordele og gruppeforhold: Patienter, der er planlagt til en Whipple-procedure eller leverresektion, er inkluderet. Informeret samtykke indhentes enten på ambulatoriet eller på indlæggelsesdagen med en uges tid til at tage stilling. Patienterne vil da også have tid til at stille spørgsmål.

Blod fra disse patienter vil blive udtaget under kirurgi under generel anæstesi fra portvenen, hepatisk vene, mesenterisk vene superior, mesenterisk vene inferior, miltvene, nyrevene og radialarterie. Forsøgsopstillingen består af 1 gang arteriel blodprøvetagning (10ml) og 1 gang intraabdominal blodprøvetagning (6x10ml), som er maksimalt 70 ml i alt. Under operationen vil blodgennemstrømningen blive målt af portvenen og leverarterien for præcist at beregne organflux. Portvenen og leverarterien er let tilgængelige for flowmåling med Transonic flowmåleren. Denne enhed er CE-certificeret og bruges rutinemæssigt til at måle den faktiske blodgennemstrømning. Der er ingen risici forbundet med måling af disse blodstrømme.

Derudover vil der blive udtaget galdeprøver under operationen (4 ml) fra galdeblæren eller leverkanalen under operationen, og der vil blive taget biopsier fra leveren (1, i tilfælde af leverresektion), galdeblæren (1), jejunum (1, i tilfælde af leverresektion). af hepaticojejunostomi), almindelig galdegang (CBD, 1). hvidt fedtvæv (WAT, fra tre steder; subkutant, omentalt og visceralt fedtvæv) og rectus abdominis muskel til genekspressionsundersøgelser af gener. Ydermere vil perioperativ afføring og urin og jejunalt indhold under operation (i tilfælde af hepaticojejunostomi) blive indsamlet til detaljeret analyse af mikrobiota/galdesaltsammensætning for at undersøge effekten af ​​obstruktiv kolestase på disse parametre. Patienterne vil blive vurderet for sværhedsgraden af ​​kløe ved hjælp af et spørgeskema (visuel analog skala og 5D kløeskala) dagen før operationen for at korrelere flux til kolestatisk kløe.

De anvendte metoder, dvs. arteriel og intraabdominal blodprøvetagning og udtagning af lever-/jejunale biopsier som led i planlagt resektion, er tidligere blevet anvendt uden konsekvenser for de kirurgiske indgreb eller patienterne. I sammenligning med tidligere etisk godkendte protokoller vil galde (4 ml) blive udtaget fra galdeblæren eller leverkanalen under operationen, og biopsier af galdeblæren (1x), CBD (1x) og WAT (3x) samt afføring vil blive indsamlet én gang præoperativt. Der er ingen yderligere risici forbundet med opsamling af galde og væv, da disse er en del af det resekerede væv. Biopsien af ​​tyndtarmen, hvidt fedtvæv og rectus abdominis-muskel vil blive taget fra dele, der vil blive resekeret under operationen eller fra det kirurgiske snitsted, hvilket forhindrer risikoen for permanente komplikationer. Potentiel peroperativ blødning af vævet vil blive elektrokoaguleret af kirurgen. Abdominale biopsier vil blive taget af dygtige hepatopancreaticobiliære kirurger. Der er ingen yderligere risiko forbundet med opsamling af præoperativ afføring og urin. Selvom resultaterne af dette projekt ikke har nogen direkte positive effekter for de involverede patienter, bidrager de til forståelsen af ​​rollen af ​​galdesalte og FGF19-signalering under kolestatiske forhold. Indsigt fra denne undersøgelse ville give nyhed og væsentlig viden om mulige effekter af FGF19-terapi ved kolestatisk leverskade.