FGF19 in Colestasi ostruttiva: "Svela il segnale" (FOCUS)

Poiché i sali biliari sono emulsionanti biologici, svolgono un ruolo essenziale nella digestione e nell'assorbimento dei lipidi alimentari e delle vitamine liposolubili. I sali biliari agiscono anche come potenti molecole di segnalazione che prendono di mira i recettori legati alla membrana nucleare e plasmacellulare che rilevano i sali biliari. Diversi processi metabolici e biologici sono influenzati dall'attivazione di questi recettori, tra cui l'omeostasi dei sali biliari e del glucosio, la termogenesi, la funzione di barriera intestinale e la rigenerazione del fegato.

I sali biliari sono sintetizzati nel fegato e restituiti efficacemente al fegato attraverso il lume intestinale e il sangue portale (circolazione enteroepatica = EHC). Il contenuto di sali biliari epatici è strettamente regolato a più livelli per mantenere livelli non tossici. Il fattore di trascrizione Farnesoid X Receptor (FXR) svolge un ruolo chiave nell'omeostasi dei sali biliari regolando la sintesi, l'escrezione biliare, la ricaptazione intestinale e il metabolismo dei sali biliari. La carenza genetica di FXR nei topi si traduce in una compromissione della funzione della barriera intestinale, nel metabolismo epatico disregolato e nel recupero compromesso dalla lesione epatica colestatica. I sali biliari reprimono la propria biosintesi, e questo comprende l'attivazione di FXR da parte dei sali biliari nel tessuto enteroepatico e il controllo della trascrizione di Cyp7a1 nel fegato (enzima limitante la velocità della sintesi dei sali biliari). L'FXR epatico attivato reprime l'enzima sintetico del sale biliare Cyp7a1 inducendo l'espressione di Shp. D'altra parte, l'FXR attivato nell'ileo induce l'espressione di FGF19 che segnala al fegato di reprimere l'espressione di Cyp7a1. Il fegato è considerato il bersaglio primario di FGF19 in quanto esprime entrambi i componenti del complesso del recettore FGF19 (FGFR4-βklotho). Gli esperimenti sugli animali hanno dimostrato un ruolo cruciale dell'FXR intestinale nella prevenzione della crescita eccessiva batterica e nel mantenimento dell'integrità intestinale in un modello murino di colestasi ostruttiva. Inoltre, l'attivazione intestinale di FXR ha migliorato il danno epatico colestatico nei topi con legatura del dotto biliare. Ciò sottolinea che un EHC intatto è fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti nell'intestino tenue e nel fegato.

Nei pazienti con colestasi ostruttiva (ad es. cancro al pancreas e colangiocarcinoma). L'assenza di bile nel tratto intestinale è associata a queste anomalie. I ricercatori postulano che il normale flusso biliare nei pazienti con colestasi ostruttiva sia compromesso e quindi la segnalazione del sale biliare sia compromessa portando a disregolazione nei tessuti enteroepatici. Per migliorare ulteriormente la nostra comprensione della segnalazione del sale biliare-FGF19 attraverso diversi organi addominali, i ricercatori otterranno campioni di sangue non solo dall'arteria radiale, dal portale e dalla vena epatica, ma anche dalla vena mesenterica superiore, dalla vena mesenterica inferiore, dalla vena splenica vena e la vena renale. Includendo questi vasi sanguigni, i ricercatori saranno in grado di ottenere informazioni sul contributo dell'intestino tenue, del colon, della milza e dei reni, separatamente nella produzione o estrazione di FGF19 nell'uomo. Vale a dire, le differenze artero-venose (ΔAV) e i flussi netti di organi (flusso x ΔAV) servono come misura quantitativa dello scambio di metaboliti attraverso i visceri portale drenati (PDV), l'area splancnica e l'intestino tenue, il colon, la milza e i reni.

L'ipotesi è che il flusso interorgano di FGF19 si sposti durante la colestasi ostruttiva verso la produzione o il rilascio di FGF19 da parte di altri organi addominali piuttosto che dell'intestino tenue. L'elevazione sierica di FGF19 e ​​l'espressione di mRNA di FGF19 nel fegato di pazienti con colestasi ostruttiva supportano questo concetto.

Lo scopo di questo studio è indagare la segnalazione di FGF19 in pazienti con colestasi rispetto ai pazienti non colestatici calcolando i flussi attraverso gli organi portali drenati. In secondo luogo, i ricercatori studieranno le conseguenze metaboliche e funzionali (glucosio, omeostasi lipidica, prurito colestatico, funzione di barriera intestinale, composizione dei sali biliari) di un percorso FXR-FGF19 disturbato nell'uomo. I risultati di questo studio forniranno nuove informazioni sulla segnalazione del sale biliare enteroepatico-FGF19 negli esseri umani e potrebbero portare a potenziali strategie terapeutiche nelle malattie del fegato colestatico.

Obiettivo primario

• Determinare i flussi interorgano in vivo di FGF19 in pazienti con colestasi ostruttiva rispetto a pazienti non colestatici e pazienti drenati

Obiettivi secondari

• Determinare i flussi organici dei sali biliari (specie) nei pazienti con colestasi ostruttiva rispetto ai pazienti non colestatici (gruppo di controllo) e ai pazienti drenati (gruppo EHC ripristinato)
• Determinare l'espressione genica dei geni implicati nel sale biliare e nella segnalazione FGF19 nei tessuti enteroepatici (fegato, digiuno, cistifellea, dotto biliare comune, tessuto adiposo bianco) e tessuto muscolare scheletrico di pazienti con colestasi ostruttiva rispetto a pazienti non colestatici (gruppo di controllo) e pazienti drenati (gruppo EHC restaurato).
• Determinare il microbiota dei pazienti con colestasi ostruttiva rispetto ai pazienti non colestatici (gruppo di controllo) e ai pazienti drenati (gruppo EHC ripristinato) nelle feci preoperatorie e nel contenuto fecale intraluminale intraoperatorio.
• Determinare la composizione dei sali biliari in pazienti con pazienti non colestatici (gruppo di controllo) e pazienti drenati (gruppo EHC ripristinato) nel plasma, nelle urine e nella bile.
• Determinare se i flussi di metaboliti (ad es. sali biliari, FGF19) sono correlati al prurito colestatico

Dai pazienti che partecipano allo studio verranno raccolti i) sangue, ii) tessuto da materiale resecato, iii) bile, iv) feci, v) urina, vi) contenuto digiunale e vii) informazioni sulla gravità del prurito. Poiché i vasi sanguigni indicati di seguito sono facilmente accessibili nei pazienti sottoposti a pancreaticoduodenectomia con conservazione del piloro (pp Whipple) o resezione epatica, questi pazienti sono idonei per lo studio e saranno inclusi. Prima del prelievo di sangue, il flusso sanguigno della vena porta e dell'arteria epatica verrà misurato immediatamente con il misuratore di flusso sanguigno Transonic. Il sangue verrà prelevato dai seguenti vasi:

vena porta, vena epatica, vena mesenterica superiore, vena mesenterica inferiore, vena splenica, vena renale, arteria radiale

Le differenze arterovenose (ΔAV) e i flussi netti di organi (flusso x ΔAV) sono una misura quantitativa del ruolo del fegato, del PDV, dell'area splancnica, dell'intestino tenue, del colon, della milza e dei reni nella produzione o estrazione di FGF19 e ​​sali biliari. I flussi saranno calcolati misurando i livelli plasmatici dei metaboliti e determinando il flusso sanguigno in questi vasi.

Tutti i pazienti sottoposti a pp Whipple o resezione epatica hanno un catetere arterioso durante l'intervento chirurgico da cui gli investigatori possono prelevare il sangue. Le vene menzionate (6x) saranno perforate direttamente usando aghi da 25G. 10 ml di sangue arterioso e 10 ml di sangue intra-addominale dai diversi vasi saranno prelevati separatamente una volta durante l'intervento chirurgico, ottenendo una quantità totale di sangue prelevato di massimo 70 ml. Tutti i campioni di sangue saranno raccolti sia in tubi sottovuoto EDTA pre-raffreddati che eparinizzati e centrifugati a 3500 rpm a 4°C per 10 minuti. Il plasma sarà conservato in tazze Eppendorf a -80°C fino a ulteriori analisi. Il flusso sanguigno sarà misurato utilizzando l'ecografia Duplex intraoperatoria.

I tessuti saranno esplorati mediante istologia (istochimica, immunoistochimica/fluorescente) e per un'analisi dettagliata dei geni implicati nella segnalazione del sale biliare-FGF19 e ​​nei processi metabolici (ad es. omeostasi del glucosio, omeostasi dei lipidi). I seguenti tessuti (da materiale resecato) durante l'intervento chirurgico saranno raccolti consentendo uno studio dettagliato dei geni implicati nella segnalazione del sale biliare-FGF19 nei tessuti enteroepatici:

campione di fegato (in caso di resezione epatica), campione di colecisti, campione del dotto biliare comune, campione digiunale prossimale (in caso di epaticodigiunostomia durante la procedura chirurgica), tessuto adiposo bianco (WAT) [sottocutaneo, omentale, viscerale], muscolo retto dell'addome

Uno studio precedente ha mostrato che la bile umana contiene alti livelli di FGF19. Tuttavia, l'esatto ruolo funzionale dell'FGF19 nella bile non è noto. Pertanto, la bile sarà raccolta intraoperatoriamente per studiare l'effetto della colestasi ostruttiva sui livelli di FGF19 nella bile. La bile verrà raccolta mediante puntura della cistifellea dopo la rimozione o dal dotto biliare epatico nel caso in cui la cistifellea non sia in situ.

Il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nell'omeostasi dei sali biliari mediante modificazione secondaria e deconiugazione dei sali biliari primari. La composizione microbica (ad es. sarà analizzato lo spostamento dei batteri produttori di idrolasi dei sali biliari) delle feci preoperatorie e il contenuto prossimale del digiuno durante l'intervento chirurgico. Il plasma dei tre gruppi di pazienti (controllo, drenato e colestatico) sarà analizzato per i marcatori della funzione degli enterociti (ad es. citrullina) e danni agli enterociti (ad es. IFABP), danno transmurale (SM22), endotossine (LBP), citochine pro-infiammatorie (IL-6 e TNF-alfa) e nuovi marcatori per l'infiammazione epatica (catepsina).

Il prurito colestatico (prurito) è comune nei pazienti con colestasi ostruttiva. La fonte del prurito è attualmente sconosciuta e i sali biliari sono implicati nello sviluppo del prurito colestatico. Pertanto gli investigatori vorrebbero chiedere ai pazienti di segnare l'intensità del loro prurito il giorno prima dell'intervento chirurgico mediante una scala analogica visiva (VAS, una scala da 0 (nessun prurito) a 10 (peggior prurito possibile)). Inoltre, gli investigatori chiederanno loro di compilare un breve questionario, la scala del prurito 5D. Metaboliti implicati nel prurito (ad es. sali biliari) saranno analizzati nei campioni di sangue per calcolare i flussi e questi saranno correlati con i punteggi VAS preoperatori e la scala del prurito 5D.

L'urina sarà anche raccolta prima dell'intervento di tutti i pazienti per verificare se la colestasi influenza la via di escrezione dei sali biliari (dall'escrezione biliare all'escrezione renale). La composizione dei sali biliari sarà analizzata nelle urine mediante spettrometria di massa mediante cromatografia liquida (LC-MS).

Principali parametri/endpoint dello studio: il parametro principale dello studio è il flusso netto di FGF19 attraverso gli organi addominali, calcolato misurando i livelli di FGF19 nel plasma umano utilizzando un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) in pazienti colestatici rispetto a pazienti non colestatici e pazienti drenati . Il plasma umano sarà ottenuto durante l'intervento chirurgico da 7 vasi i) arteria radiale, ii) vena mesenterica superiore, iii) vena mesenterica inferiore, iv) vena renale, v) vena splenica, vi) vena epatica e vii) vena porta per calcolare l'organo netto flussi. Parametri secondari sono l'espressione di geni correlati al sale biliare e alla segnalazione di FGF19 nei tessuti enteroepatici (fegato, digiuno, cistifellea, dotto biliare comune, tessuto adiposo bianco e tessuto muscolare scheletrico), geni implicati nell'omeostasi del glucosio e dei lipidi, livelli di FGF19 nella bile, nell'intestino microbiota, prurito colestatico e composizione dei sali biliari nelle urine.

Natura ed entità dell'onere e dei rischi associati alla partecipazione, al beneficio e alla parentela di gruppo: sono inclusi i pazienti pianificati per una procedura di Whipple o una resezione epatica. Il consenso informato sarà ottenuto presso il reparto ambulatoriale o il giorno del ricovero, con una settimana di tempo per decidere. I pazienti avranno quindi anche il tempo di porre domande.

Il sangue di questi pazienti verrà prelevato durante l'intervento chirurgico in anestesia generale dalla vena porta, dalla vena epatica, dalla vena mesenterica superiore, dalla vena mesenterica inferiore, dalla vena splenica, dalla vena renale e dall'arteria radiale. Il set-up sperimentale consiste in 1 prelievo di sangue arterioso (10 ml) e 1 prelievo di sangue intra-addominale (6x10 ml), per un massimo di 70 ml in totale. Durante l'intervento chirurgico verrà misurato il flusso sanguigno della vena porta e dell'arteria epatica per calcolare con precisione i flussi di organi. La vena porta e l'arteria epatica sono facilmente accessibili per la misurazione del flusso con il flussimetro Transonic. Questo dispositivo è certificato CE e utilizzato di routine per misurare il flusso sanguigno effettivo. Nessun rischio è associato alla misurazione di questi flussi sanguigni.

Inoltre, durante l'intervento chirurgico verrà prelevata la bile (4 ml) dalla cistifellea o dal dotto epatico e verranno prelevate biopsie dal fegato (1, in caso di resezione epatica), dalla cistifellea (1), dal digiuno (1, in caso di epaticodigiunostomia), coledoco (CBD, 1). tessuto adiposo bianco (WAT, da tre siti; tessuto adiposo sottocutaneo, omentale e viscerale) e muscolo retto dell'addome per studi di espressione genica dei geni. Inoltre, le feci e le urine perioperatorie e il contenuto digiunale durante l'intervento chirurgico (in caso di epaticodigiunostomia) saranno raccolti per un'analisi dettagliata della composizione del microbiota / sali biliari per studiare l'effetto della colestasi ostruttiva su questi parametri. I pazienti saranno valutati per la gravità del prurito da un questionario (scala analogica visiva e scala del prurito 5D) il giorno prima dell'intervento chirurgico per correlare i flussi al prurito colestatico.

I metodi applicati, vale a dire il prelievo di sangue arterioso e intraddominale e la raccolta di biopsie epatiche/digiunali come parte della resezione pianificata, sono stati utilizzati in precedenza senza alcuna conseguenza per le procedure chirurgiche o per i pazienti. Rispetto ai protocolli precedentemente etici approvati, durante l'intervento chirurgico verrà prelevata la bile (4 ml) dalla cistifellea o dal dotto epatico e verranno prelevate biopsie della cistifellea (1x), CBD (1x) e WAT (3x), nonché delle feci raccolti una volta prima dell'intervento. Non ci sono rischi aggiuntivi legati alla raccolta di bile e tessuti poiché questi fanno parte dei tessuti resecati. La biopsia dell'intestino tenue, del tessuto adiposo bianco e del muscolo retto dell'addome verrà prelevata dalle parti che verranno resecate durante l'intervento o dal sito di incisione chirurgica, prevenendo così il rischio di complicanze permanenti. Il potenziale sanguinamento peroperatorio del tessuto verrà elettrocoagulato dal chirurgo. Le biopsie addominali saranno prelevate da esperti chirurghi epatopancreaticobiliari. Nessun ulteriore rischio è associato alla raccolta delle feci e delle urine preoperatorie. Sebbene i risultati di questo progetto non abbiano effetti positivi diretti per i pazienti coinvolti, contribuiscono alla comprensione del ruolo dei sali biliari e della segnalazione di FGF19 in condizioni colestatiche. Gli approfondimenti di questo studio fornirebbero novità e conoscenze sostanziali sui possibili effetti della terapia con FGF19 nel danno epatico colestatico.