FGF19 bei obstruktiver Cholestase: „Das Signal enthüllen“ (FOCUS)

Da Gallensalze biologische Emulgatoren sind, spielen sie eine wesentliche Rolle bei der Verdauung und Absorption von Nahrungslipiden und fettlöslichen Vitaminen. Gallensalze wirken auch als potente Signalmoleküle, die auf zellmembrangebundene Rezeptoren für die Gallensalz-Erkennung abzielen. Mehrere metabolische und biologische Prozesse werden durch die Aktivierung dieser Rezeptoren beeinflusst, darunter Gallensalz- und Glukosehomöostase, Thermogenese, intestinale Barrierefunktion und Leberregeneration.

Gallensalze werden in der Leber synthetisiert und effizient über das Darmlumen und das Pfortaderblut (enterohepatischer Kreislauf = EHC) in die Leber zurückgeführt. Der hepatische Gallensalzgehalt wird auf mehreren Ebenen streng reguliert, um ungiftige Werte aufrechtzuerhalten. Der Transkriptionsfaktor Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) spielt eine Schlüsselrolle bei der Homöostase der Gallensalze, indem er die Synthese, die biliäre Ausscheidung, die Wiederaufnahme im Darm und den Metabolismus von Gallensalzen reguliert. Ein genetischer FXR-Mangel bei Mäusen führt zu einer beeinträchtigten Darmbarrierefunktion, einem fehlregulierten Leberstoffwechsel und einer beeinträchtigten Erholung von einer cholestatischen Leberschädigung. Gallensalze unterdrücken ihre eigene Biosynthese, und dies umfasst die Aktivierung von FXR durch Gallensalze im enterohepatischen Gewebe und die Kontrolle der Transkription von Cyp7a1 in der Leber (geschwindigkeitsbestimmendes Enzym der Gallensalzsynthese). Aktivierter hepatischer FXR unterdrückt das Gallensalz-synthetische Enzym Cyp7a1, indem es die Expression von Shp induziert. Andererseits induziert aktivierter FXR im Ileum die Expression von FGF19, was der Leber signalisiert, die Expression von Cyp7a1 zu unterdrücken. Die Leber gilt als primäres Ziel von FGF19, da sie beide Komponenten des FGF19-Rezeptorkomplexes (FGFR4-βklotho) exprimiert. Tierexperimente zeigten eine entscheidende Rolle des intestinalen FXR bei der Verhinderung einer bakteriellen Überwucherung und der Aufrechterhaltung der Darmintegrität in einem Mausmodell für obstruktive Cholestase. Darüber hinaus verbesserte die intestinale FXR-Aktivierung die cholestatische Leberschädigung bei Gallengang-ligierten Mäusen. Dies unterstreicht, dass ein intakter EHC entscheidend ist, um die Gewebehomöostase im Dünndarm und in der Leber aufrechtzuerhalten.

Bei Patienten mit obstruktiver Cholestase (z. Bauchspeicheldrüsenkrebs und Cholangiokarzinom). Das Fehlen von Galle im Darmtrakt ist mit diesen Anomalien verbunden. Die Forscher postulieren, dass der normale Gallenfluss bei Patienten mit obstruktiver Cholestase beeinträchtigt ist und daher die Gallensalzsignalisierung beeinträchtigt ist, was zu einer Dysregulation in enterohepatischen Geweben führt. Um unser Verständnis der Gallensalz-FGF19-Signalübertragung in verschiedenen Bauchorganen weiter zu verbessern, werden die Forscher Blutproben nicht nur aus der Radialarterie, der Pfortader und der Lebervene, sondern auch aus der oberen Mesenterialvene, der unteren Mesenterialvene und der Milz entnehmen Vene und die Nierenvene. Durch die Einbeziehung dieser Blutgefäße werden die Forscher in der Lage sein, Informationen über den Beitrag des Dünndarms, des Dickdarms, der Milz und der Nieren getrennt voneinander bei der Produktion oder Extraktion von FGF19 beim Menschen zu erhalten. Arteriovenöse Differenzen (ΔAV) und Netto-Organflüsse (Fluss x ΔAV) dienen nämlich als quantitatives Maß für den Metabolitenaustausch über die portaldrainierten Eingeweide (PDV), den Splanchnikusbereich und den Dünndarm, Dickdarm, Milz und Nieren.

Die Hypothese ist, dass sich der FGF19-Fluss zwischen den Organen während der obstruktiven Cholestase in Richtung der Produktion oder Freisetzung von FGF19 durch andere Bauchorgane und nicht durch den Dünndarm verschiebt. Serum-FGF19-Erhöhung und FGF19-mRNA-Expression in der Leber von Patienten mit obstruktiver Cholestase unterstützen dieses Konzept.

Das Ziel dieser Studie ist es, die FGF19-Signalgebung bei Patienten mit Cholestase im Vergleich zu Patienten ohne Cholestase zu untersuchen, indem die Flüsse durch die portaldrainierten Organe berechnet werden. Zweitens werden die Forscher die metabolischen und funktionellen Folgen (Glukose, Lipidhomöostase, cholestatischer Juckreiz, Darmbarrierefunktion, Gallensalzzusammensetzung) eines gestörten FXR-FGF19-Signalwegs beim Menschen untersuchen. Die Ergebnisse dieser Studie werden neue Einblicke in die enterohepatische Gallensalz-FGF19-Signalübertragung beim Menschen liefern und können zu potenziellen therapeutischen Strategien bei cholestatischen Lebererkrankungen führen.

Hauptziel

• Bestimmung der In-vivo-Interorganflüsse von FGF19 bei Patienten mit obstruktiver Cholestase im Vergleich zu Patienten ohne Cholestase und Patienten mit Drainage

Sekundäre Ziele

• Bestimmung der Organflüsse von Gallensalzen (Spezies) bei Patienten mit obstruktiver Cholestase im Vergleich zu nicht-cholestatischen Patienten (Kontrollgruppe) und drainierten Patienten (restaurierte EHC-Gruppe)
• Bestimmung der Genexpression von Genen, die an der Gallensalz- und FGF19-Signalübertragung in enterohepatischen Geweben (Leber, Jejunum, Gallenblase, Choledochus, weißes Fettgewebe) und Skelettmuskelgewebe von Patienten mit obstruktiver Cholestase im Vergleich zu nicht-cholestatischen Patienten (Kontrollgruppe) beteiligt sind und ausgelaugte Patienten (wiederhergestellte EHC-Gruppe).
• Bestimmen Sie die Mikrobiota von Patienten mit obstruktiver Cholestase im Vergleich zu nicht cholestatischen Patienten (Kontrollgruppe) und entleerten Patienten (restaurierte EHC-Gruppe) im präoperativen Stuhl und intraoperativen intraluminalen Stuhlinhalt.
• Bestimmen Sie die Gallensalzzusammensetzung bei Patienten mit nicht-cholestatischen Patienten (Kontrollgruppe) und entleerten Patienten (restaurierte EHC-Gruppe) in Plasma, Urin und Galle.
• Bestimmen Sie, ob Flüsse von Metaboliten (z. Gallensalze, FGF19) sind mit cholestatischem Juckreiz verwandt

Von den an der Studie teilnehmenden Patienten werden i) Blut, ii) Gewebe aus reseziertem Material, iii) Galle, iv) Stuhl, v) Urin, vi) Inhalt des Jejunums und vii) Informationen über die Schwere des Juckreizes gesammelt. Da die unten angegebenen Blutgefäße bei Patienten, die sich einer pyloruserhaltenden Pankreatikoduodenektomie (pp Whipple) oder einer Leberresektion unterziehen, leicht zugänglich sind, sind diese Patienten für die Studie geeignet und werden eingeschlossen. Vor der Blutentnahme wird der Blutfluss der Pfortader und der Leberarterie sofort mit dem Transonic-Blutflussmessgerät gemessen. Aus folgenden Gefäßen wird Blut entnommen:

Pfortader, Lebervene, V. mesenterica superior, V. mesenterica inferior, Milzvene, Nierenvene, Radialarterie

Arteriovenöse Differenzen (ΔAV) und Nettoorganflüsse (Fluss x ΔAV) sind ein quantitatives Maß für die Rolle der Leber, des PDV, des Splanchnikusbereichs, des Dünndarms, des Dickdarms, der Milz und der Nieren bei der Produktion oder Extraktion von FGF19 und Gallensalzen. Die Flüsse werden berechnet, indem Plasmaspiegel von Metaboliten gemessen und der Blutfluss in diesen Gefäßen bestimmt werden.

Alle Patienten, die sich einer pp. Whipple- oder Leberresektion unterziehen, haben während der Operation einen Arterienkatheter, aus dem die Ermittler Blut entnehmen können. Die genannten Venen (6x) werden direkt mit 25G Nadeln punktiert. Während der Operation werden einmalig 10 ml arterielles Blut und 10 ml intraabdominelles Blut aus den verschiedenen Gefäßen separat entnommen, so dass sich eine Gesamtmenge an entnommenem Blut von maximal 70 ml ergibt. Alle Blutproben werden in vorgekühlten EDTA- und heparinisierten Vakuumröhrchen entnommen und 10 Minuten lang bei 3500 U/min bei 4 °C zentrifugiert. Das Plasma wird bis zur weiteren Analyse in Eppendorf Cups bei -80 °C gelagert. Der Blutfluss wird mittels intraoperativem Duplex-Ultraschall gemessen.

Gewebe werden histologisch (Histochemie, Immunhistochemie/Fluoreszenz) und zur detaillierten Analyse von Genen untersucht, die an der Gallensalz-FGF19-Signalübertragung und Stoffwechselprozessen beteiligt sind (z. Glukosehomöostase, Lipidhomöostase). Die folgenden Gewebe (aus reseziertem Material) werden während der Operation gesammelt, um eine detaillierte Untersuchung der Gene zu ermöglichen, die an der Gallensalz-FGF19-Signalübertragung in enterohepatischen Geweben beteiligt sind:

Leberprobe (bei Leberresektion), Gallenblasenprobe, Gallengangsprobe, proximale Jejunalprobe (bei Hepatikojejunostomie während eines chirurgischen Eingriffs), weißes Fettgewebe (WAT) [subkutan, omental, viszeral], M. rectus abdominis

Frühere Studien zeigten, dass menschliche Galle hohe Konzentrationen an FGF19 enthält. Die genaue funktionelle Rolle von FGF19 in der Galle ist jedoch nicht bekannt. Daher wird Galle intraoperativ gesammelt, um die Wirkung der obstruktiven Cholestase auf die FGF19-Spiegel in der Galle zu untersuchen. Die Galle wird durch Punktion der Gallenblase nach der Entfernung oder aus dem Lebergallengang gesammelt, falls die Gallenblase nicht in situ ist.

Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Gallensalz-Homöostase durch sekundäre Modifikation und Dekonjugation von primären Gallensalzen. Die mikrobielle Zusammensetzung (z. Verschiebung der Gallensäurehydrolase-produzierenden Bakterien) des präoperativen Stuhls und des proximalen jejunalen Inhalts während der Operation werden analysiert. Das Plasma der drei Patientengruppen (Kontrolle, Drainage und Cholestase) wird auf Marker der Enterozytenfunktion (z. Citrullin) und Enterozytenschäden (z. IFABP), transmuraler Schaden (SM22), Endotoxine (LBP), entzündungsfördernde Zytokine (IL-6 und TNF-alpha) und neuartige Marker für Leberentzündungen (Cathepsin).

Cholestatischer Pruritis (Juckreiz) tritt häufig bei Patienten mit obstruktiver Cholestase auf. Die Quelle des Juckreizes ist derzeit unbekannt, und Gallensalze sind an der Entwicklung des cholestatischen Juckreizes beteiligt. Daher möchten die Untersucher die Patienten bitten, ihre Juckreizintensität am Tag vor der Operation mittels einer visuellen Analogskala (VAS, einer Skala von 0 (kein Juckreiz) bis 10 (stärkster Juckreiz möglich)) zu bewerten. Darüber hinaus werden die Ermittler sie bitten, einen kurzen Fragebogen, die 5D-Juckskala, auszufüllen. Stoffwechselprodukte, die an Juckreiz beteiligt sind (z. Gallensalze) werden in den Blutproben analysiert, um Flüsse zu berechnen, und diese werden mit den präoperativen VAS-Scores und der 5D-Juckskala korreliert.

Außerdem wird präoperativ von allen Patienten Urin gesammelt, um zu untersuchen, ob die Cholestase den Weg der Gallensalzausscheidung (von der biliären Ausscheidung zur renalen Ausscheidung) beeinflusst. Die Gallensalzzusammensetzung wird im Urin mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert.

Hauptstudienparameter/-endpunkte: Der Hauptstudienparameter ist der Nettoorganfluss von FGF19 durch die Bauchorgane, der durch Messung der FGF19-Spiegel in menschlichem Plasma unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISA) bei cholestatischen versus nicht-cholestatischen Patienten und Patienten mit Drainage berechnet wird . Menschliches Plasma wird während der Operation aus 7 Gefäßen i) Radialarterie, ii) Mesenterica Superior Vene, iii) Mesenterica Inferior Vene, iv) Nierenvene, v) Milzvene, vi) Lebervene und vii) Pfortader zur Berechnung des Nettoorgans entnommen Flüsse. Sekundäre Parameter sind die Expression von Genen, die mit der Gallensalz- und FGF19-Signalübertragung in enterohepatischen Geweben (Leber, Jejunum, Gallenblase, Choledochus, weißes Fettgewebe und Skelettmuskelgewebe) in Verbindung stehen, Gene, die an der Glukose- und Lipidhomöostase beteiligt sind, FGF19-Spiegel in Galle, Darm Mikrobiota, cholestatischer Juckreiz und Gallensalzzusammensetzung im Urin.

Art und Ausmaß der mit der Teilnahme verbundenen Belastungen und Risiken, Nutzen und Gruppenbezug: Eingeschlossen sind Patienten, bei denen ein Whipple-Eingriff oder eine Leberresektion geplant sind. Die Einverständniserklärung wird entweder in der Ambulanz oder am Tag der Aufnahme mit einer Entscheidungsfrist von einer Woche eingeholt. Patienten haben dann auch Zeit, Fragen zu stellen.

Blut dieser Patienten wird während der Operation unter Vollnarkose aus der Pfortader, der Lebervene, der oberen Mesenterialvene, der unteren Mesenterialvene, der Milzvene, der Nierenvene und der Radialarterie entnommen. Der Versuchsaufbau besteht aus 1 x arterieller Blutentnahme (10 ml) und 1 x intraabdomineller Blutentnahme (6 x 10 ml), was insgesamt maximal 70 ml entspricht. Während der Operation wird der Blutfluss der Pfortader und der Leberarterie gemessen, um die Organflüsse genau zu berechnen. Die Pfortader und die Leberarterie sind für die Durchflussmessung mit dem Transonic-Durchflussmesser leicht zugänglich. Dieses Gerät ist CE-zertifiziert und wird routinemäßig zur Messung des tatsächlichen Blutflusses verwendet. Mit der Messung dieser Blutflüsse sind keine Risiken verbunden.

Zusätzlich wird während der Operation Galle (4 ml) aus der Gallenblase oder dem Lebergang während der Operation entnommen, und Biopsien werden aus der Leber (1, im Falle einer Leberresektion), der Gallenblase (1), dem Jejunum (1, im Falle Hepatikojejunostomie), Choledochus (CBD, 1). weißes Fettgewebe (WAT, von drei Stellen; subkutanes, omentales und viszerales Fettgewebe) und M. rectus abdominis für Genexpressionsstudien von Genen. Darüber hinaus werden perioperativer Stuhl und Urin sowie jejunaler Inhalt während der Operation (im Falle einer Hepatikojejunostomie) für eine detaillierte Analyse der Zusammensetzung von Mikrobiota/Gallesalz gesammelt, um die Auswirkung einer obstruktiven Cholestase auf diese Parameter zu untersuchen. Die Patienten werden am Tag vor der Operation anhand eines Fragebogens (visuelle Analogskala und 5D-Juckreizskala) auf die Schwere des Juckreizes untersucht, um die Flüsse mit dem cholestatischen Juckreiz zu korrelieren.

Die angewandten Methoden, d. h. die arterielle und intraabdominale Blutentnahme sowie die Entnahme von Leber-/Leerdarmbiopsien im Rahmen einer geplanten Resektion, wurden bisher ohne Folgen für die chirurgischen Eingriffe oder die Patienten angewendet. Im Vergleich zu zuvor ethisch zugelassenen Protokollen wird während der Operation Galle (4 ml) aus der Gallenblase oder dem Lebergang entnommen und es werden Biopsien der Gallenblase (1x), CBD (1x) und WAT (3x) sowie des Stuhls durchgeführt einmal präoperativ erhoben. Es bestehen keine zusätzlichen Risiken im Zusammenhang mit der Entnahme von Galle und Gewebe, da diese Teil des resezierten Gewebes sind. Die Biopsie des Dünndarms, des weißen Fettgewebes und des M. rectus abdominis wird von Teilen entnommen, die während der Operation reseziert werden, oder von der chirurgischen Inzisionsstelle, wodurch das Risiko dauerhafter Komplikationen vermieden wird. Mögliche peroperative Blutungen des Gewebes werden vom Chirurgen elektrokoaguliert. Bauchbiopsien werden von erfahrenen hepatopankreatikobiliären Chirurgen entnommen. Mit der Sammlung von präoperativem Stuhl und Urin ist kein weiteres Risiko verbunden. Obwohl die Ergebnisse dieses Projekts keine direkten positiven Effekte für die beteiligten Patienten haben, tragen sie zum Verständnis der Rolle von Gallensalzen und der FGF19-Signalübertragung unter cholestatischen Bedingungen bei. Erkenntnisse aus dieser Studie würden Neuheit und wesentliches Wissen über mögliche Wirkungen der FGF19-Therapie bei cholestatischer Leberschädigung liefern.