FGF19 i Obstructive Cholestasis: "Unveil the Signal" (FOCUS)

Eftersom gallsalter är biologiska emulgeringsmedel, spelar de en viktig roll i matsmältningen och absorptionen av kostens lipider och fettlösliga vitaminer. Gallsalter fungerar också som potenta signalmolekyler som riktar sig mot gallsaltavkännande nukleära och plasmacellmembranbundna receptorer. Flera metaboliska och biologiska processer påverkas av aktivering av dessa receptorer, inklusive gallsalt och glukoshomeostas, termogenes, tarmbarriärfunktion och leverregenerering.

Gallsalter syntetiseras i levern och återförs effektivt till levern via tarmens lumen och portalblod (enterohepatisk cirkulation = EHC). Innehållet av gallsalt i levern är strikt reglerat på flera nivåer för att upprätthålla icke-toxiska nivåer. Transkriptionsfaktorn Farnesoid X Receptor (FXR) spelar en nyckelroll i gallsalthomeostas genom att reglera syntes, gallutsöndring, intestinalt återupptag och metabolism av gallsalter. Genetisk brist på FXR hos möss resulterar i försämrad tarmbarriärfunktion, oreglerad levermetabolism och försämrad återhämtning från kolestatisk leverskada. Gallsalter undertrycker sin egen biosyntes, och detta omfattar aktivering av FXR av gallsalter i den enterohepatiska vävnaden och kontrollerar transkriptionen av Cyp7a1 i levern (hastighetsbegränsande enzym för gallsaltsyntes). Aktiverad lever-FXR undertrycker det syntetiska gallsaltsenzymet Cyp7a1 genom att inducera uttrycket av Shp. Å andra sidan inducerar aktiverad FXR i ileum uttrycket av FGF19 som signalerar till levern att undertrycka uttrycket av Cyp7a1. Levern anses vara det primära målet för FGF19 eftersom den uttrycker båda komponenterna i FGF19-receptorkomplexet (FGFR4-βklotho). Djurförsök visade en avgörande roll för intestinal FXR för att förhindra bakteriell överväxt och bibehålla integriteten i tarmen i en musmodell av obstruktiv kolestas. Dessutom förbättrade intestinal FXR-aktivering kolestatisk leverskada hos gallgångsligerade möss. Detta understryker att en intakt EHC är avgörande för att upprätthålla vävnadshomeostas i tunntarmen och levern.

Intraluminal bakteriell överväxt, translokation av mikrobiella endotoxiner, ökad intestinal permeabilitet, aktivering av intestinala och hepatiska inflammatoriska kaskader och endotoxemi förekommer ofta hos patienter med obstruktiv kolestas (t. pankreascancer och kolangiokarcinom). Frånvaro av galla i tarmkanalen är associerad med dessa anomalier. Utredarna postulerar att normalt gallflöde hos patienter med obstruktiv kolestas är försämrat och därför försämras gallsaltsignaleringen, vilket leder till dysreglering i enterohepatiska vävnader. För att ytterligare förbättra vår förståelse av gallsalt-FGF19-signalering över olika bukorgan kommer utredarna att ta blodprover inte bara från den radiella artären, portalen och levervenen, utan också från den övre mesenteriska venen, den inferior mesenteriska venen, mjälten. venen och njurvenen. Genom att inkludera dessa blodkärl kommer utredarna att kunna få information om bidraget från tunntarmen, tjocktarmen, mjälten och njurarna, separat vid produktion eller extraktion av FGF19 hos människor. Nämligen, arteriovenösa skillnader (ΔAV) och nettoorganflöden (flöde x ΔAV) fungerar som ett kvantitativt mått på metabolitutbyte över de porta dränerade inälvorna (PDV), det splanchniska området och tunntarmen, tjocktarmen, mjälten och njurarna.

Hypotesen är att FGF19 interorganflöde skiftar under obstruktiv kolestas mot produktion eller frisättning av FGF19 av andra bukorgan snarare än tunntarmen. Förhöjning av FGF19 i serum och uttryck av FGF19 mRNA i levern hos patienter med obstruktiv kolestas stödjer detta koncept.

Syftet med denna studie är att undersöka FGF19-signalering hos patienter med kolestas jämfört med icke-kolestatiska patienter genom att beräkna flöden över de portaldränerade organen. För det andra kommer utredarna att undersöka de metabola och funktionella konsekvenserna (glukos, lipidhomeostas, kolestatisk klåda, tarmbarriärfunktion, gallsaltsammansättning) av en störd FXR-FGF19-väg hos människor. Resultat från denna studie kommer att ge nya insikter om enterohepatisk gallsalt-FGF19-signalering hos människor och kan leda till potentiella terapeutiska strategier vid kolestatiska leversjukdomar.

Huvudmål

• Bestäm in vivo interorganflöden av FGF19 hos patienter med obstruktiv kolestas jämfört med icke-kolestatiska patienter och dränerade patienter

Sekundära mål

• Bestäm organflöden av gallsalter (arter) hos patienter med obstruktiv kolestas jämfört med icke-kolestatiska patienter (kontrollgrupp) och dränerade patienter (återställd EHC-grupp)
• Bestäm genuttryck av gener som är inblandade i gallsalt och FGF19-signalering i enterohepatiska vävnader (lever, jejunum, gallblåsa, vanlig gallgång, vita fettvävnader) och skelettmuskelvävnad hos patienter med obstruktiv kolestas jämfört med icke-kolestatiska patienter (kontrollgrupp) och dränerade patienter (återställd EHC-grupp).
• Bestäm mikrobiota hos patienter med obstruktiv kolestas jämfört med icke-kolestatiska patienter (kontrollgrupp) och dränerade patienter (återställd EHC-grupp) i preoperativ avföring och intraoperativt intraluminalt fekalt innehåll.
• Bestäm gallsaltsammansättningen hos patienter med icke-kolestatiska patienter (kontrollgrupp) och dränerade patienter (återställd EHC-grupp) i plasma, urin och galla.
• Bestäm om flöden av metaboliter (t.ex. gallsalter, FGF19) är relaterade till kolestatisk klåda

Från patienterna som deltar i studien kommer i) blod, ii) vävnad från resekerat material, iii) galla, iv) avföring, v) urin, vi) jejunalt innehåll och vii) information om kliandets svårighetsgrad att samlas in. Eftersom blodkärlen som anges nedan är lättillgängliga hos patienter som genomgår pylorusbevarande pankreaticoduodenektomi (pp Whipple) eller leverresektion, är dessa patienter berättigade till studien och kommer att inkluderas. Före blodprovstagning kommer blodflödet i portvenen och leverartären att mätas omedelbart med Transonic blodflödesmätare. Blod kommer att tas från följande kärl:

portven, leverven, superior mesenteric ven, inferior mesenteric ven, mjältven, njurven, radial artär

Arteriovenösa skillnader (ΔAV) och nettoorganflöden (flöde x ΔAV) är ett kvantitativt mått på vilken roll levern, PDV, splanchnic area, tunntarm, kolon, mjälte och njurar spelar för att producera eller extrahera FGF19 och gallsalter. Fluxen kommer att beräknas genom att mäta plasmanivåer av metaboliter och bestämma blodflödet i dessa kärl.

Alla patienter som genomgår pp Whipple eller leverresektion har en artärkateter under operationen från vilken utredarna kan ta blodprov. De nämnda venerna (6x) kommer att punkteras direkt med 25G nålar. 10 ml arteriellt blod och 10 ml intraabdominalt blod från de olika kärlen separat kommer att tas en gång under operationen vilket resulterar i en total mängd blodprov på maximalt 70 ml. Alla blodprover kommer att samlas in i både förkylda EDTA och hepariniserade vakuumrör och centrifugeras vid 3500 rpm vid 4°C i 10 minuter. Plasma kommer att förvaras i Eppendorf-koppar vid -80°C tills vidare analys. Blodflödet kommer att mätas med intraoperativ Duplex ultraljud.

Vävnader kommer att utforskas med histologi (histokemi, immunhistokemi/fluorescerande) och för detaljerad analys av gener som är inblandade i gallsalt-FGF19-signalering och metaboliska processer (t. glukoshomeostas, lipidhomeostas). Följande vävnader (från resekerat material) under operation kommer att samlas in för att möjliggöra detaljerade studier av gener som är inblandade i gallsalt-FGF19-signalering i enterohepatiska vävnader:

leverprov (vid leverresektion), gallblåseprov, vanligt gallgångsprov, proximalt jejunalt prov (vid hepaticojejunostomi under kirurgiskt ingrepp), vit fettvävnad (WAT) [subkutan, omental, visceral], rectus abdominis muskel

Tidigare studie visade att mänsklig galla innehåller höga nivåer av FGF19. Den exakta funktionella rollen för FGF19 i gallan är dock inte känd. Därför kommer galla att samlas upp intraoperativt för att undersöka effekten av obstruktiv kolestas på FGF19-nivåer i galla. Galla kommer att samlas upp genom punktering av gallblåsan efter avlägsnande eller från levergallgången om gallblåsan inte är in situ.

Tarmmikrobiotan spelar en viktig roll i gallsalthomeostas genom sekundär modifiering och dekonjugering av primära gallsalter. Den mikrobiella sammansättningen (t.ex. förändring i gallsalthydrolasproducerande bakterier) av preoperativ avföring och proximalt jejunalt innehåll under operation kommer att analyseras. Plasma från de tre patientgrupperna (kontroll, dränerad och kolestatisk) kommer att analyseras för markörer för enterocytfunktion (t.ex. citrullin) och enterocytskador (t.ex. IFABP), transmural skada (SM22), endotoxiner (LBP), pro-inflammatoriska cytokiner (IL-6 och TNF-alfa) och nya markörer för leverinflammation (Cathepsin).

Kolestatisk klåda (klåda) är vanligt hos patienter med obstruktiv kolestas. Klådan till klåda är för närvarande okänd, och gallsalter är inblandade i utvecklingen av kolestatisk klåda. Därför skulle utredarna vilja be patienterna att mäta sin kliande intensitet dagen före operationen med hjälp av en visuell analog skala (VAS, en skala från 0 (ingen klåda) till 10 (värsta möjliga klåda)). Dessutom kommer utredarna att be dem att fylla i ett kort frågeformulär, 5D itch-skalan. Metaboliter som är inblandade i klåda (t.ex. gallsalter) kommer att analyseras i blodproverna för att beräkna flöden och dessa kommer att korreleras med de preoperativa VAS-poängen och 5D itchskala.

Urin kommer också att samlas in preoperativt från alla patienter för att undersöka om kolestas påverkar vägen för gallsaltutsöndring (från gallutsöndring till renal utsöndring). Gallsaltsammansättningen kommer att analyseras i urin med vätskekromatografi masspektrometri (LC-MS).

Huvudstudieparametrar/endpoints: Huvudstudieparametern är nettoorganflödet av FGF19 över bukorganen beräknat genom att mäta FGF19-nivåer i human plasma med hjälp av en enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) hos kolestatiska kontra icke-kolestatiska patienter och dränerade patienter . Humanplasma kommer att erhållas under operationen från 7 kärl i) radial artär, ii) mesenteric superior ven, iii) mesenteric inferior ven, iv) renal ven, v) mjältven, vi) leverven och vii) portalven för att beräkna nettoorganet flöden. Sekundära parametrar är uttryck av gener relaterade till gallsalt och FGF19-signalering i enterohepatisk vävnad (lever, jejunum, gallblåsa, vanlig gallgång, vit fettvävnad och skelettmuskelvävnad), gener inblandade i glukos- och lipidhomeostas, FGF19-nivåer i galla, tarm mikrobiota, kolestatisk klåda och gallsaltsammansättning i urin.

Arten och omfattningen av bördan och riskerna förknippade med deltagande, nytta och grupprelation: Patienter som planeras för ett Whipple-förfarande eller leverresektion ingår. Informerat samtycke inhämtas antingen på öppenvårdsavdelningen eller på inläggningsdagen, med en veckas tid att bestämma. Patienterna får då också tid att ställa frågor.

Blod från dessa patienter kommer att tas under kirurgi under allmän anestesi från portvenen, levervenen, mesenterialvenen superior, mesenterialvenen inferior, mjältvenen, njurvenen och radialartären. Försöksuppställningen består av 1 gång arteriell blodprovtagning (10ml) och 1 gång intraabdominal blodprovtagning (6x10ml) vilket är maximalt 70 ml totalt. Under operationen kommer blodflödet att mätas av portvenen och leverartären för att exakt beräkna organflöden. Portvenen och leverartären är lättillgängliga för flödesmätning med Transonic flödesmätare. Denna enhet är CE-certifierad och används rutinmässigt för att mäta det faktiska blodflödet. Inga risker är förknippade med mätning av dessa blodflöden.

Dessutom kommer galla att tas under operation (4 ml) från gallblåsan eller leverkanalen under operationen, och biopsier kommer att tas från levern (1, vid leverresektion), gallblåsan (1), jejunum (1, i fall av hepaticojejunostomi), gemensam gallgång (CBD, 1). vit fettvävnad (WAT, från tre platser; subkutan, omental och visceral fettvävnad) och rectus abdominis muskel för genuttrycksstudier av gener. Dessutom kommer perioperativ avföring och urin, och jejunalt innehåll under operation (vid hepaticojejunostomi) att samlas in för detaljerad analys av mikrobiota/gallsaltsammansättning för att undersöka effekten av obstruktiv kolestas på dessa parametrar. Patienterna kommer att bedömas för svårighetsgraden av klåda genom ett frågeformulär (visuell analog skala och 5D kliande skala) dagen före operationen för att korrelera flöden till kolestatisk klåda.

De metoder som tillämpas, det vill säga arteriell och intraabdominal blodprovtagning och insamling av lever/jejunalbiopsier som en del av planerad resektion, har använts tidigare utan några konsekvenser för de kirurgiska ingreppen eller patienterna. I jämförelse med tidigare etiskt godkända protokoll kommer galla (4 ml) att tas från gallblåsan eller leverkanalen under operationen, och biopsier av gallblåsan (1x), CBD (1x) och WAT (3x), samt avföring kommer att tas. samlas in en gång preoperativt. Det finns inga ytterligare risker relaterade till uppsamling av galla och vävnader eftersom dessa är en del av de resekerade vävnaderna. Biopsi av tunntarmen, vit fettvävnad och rectus abdominis-muskeln kommer att tas från delar som kommer att avlägsnas under operationen eller från det kirurgiska snittet, vilket förhindrar risken för permanenta komplikationer. Potentiell peroperativ blödning av vävnaden kommer att elektrokoaguleras av kirurgen. Bukbiopsier kommer att tas av skickliga hepatopankreaticobiliärkirurger. Ingen ytterligare risk är förknippad med uppsamling av preoperativ avföring och urin. Även om resultaten av detta projekt inte har några direkta positiva effekter för de inblandade patienterna, bidrar de till förståelsen av rollen av gallsalter och FGF19-signalering under kolestatiska förhållanden. Insikter från denna studie skulle ge nyhet och betydande kunskap om möjliga effekter av FGF19-terapi vid kolestatisk leverskada.