FGF19 i obstruktiv kolestase: "Avslør signalet" (FOCUS)

Fordi gallesalter er biologiske emulgatorer, spiller de en viktig rolle i fordøyelsen og absorpsjonen av kostholdslipider og fettløselige vitaminer. Gallesalter fungerer også som potente signalmolekyler rettet mot gallesalt-følende kjerne- og plasmacellemembranbundne reseptorer. Flere metabolske og biologiske prosesser påvirkes av aktivering av disse reseptorene, inkludert gallesalt- og glukosehomeostase, termogenese, tarmbarrierefunksjon og leverregenerering.

Gallesalter syntetiseres i leveren, og returneres effektivt til leveren via tarmlumen og portalblod (enterohepatisk sirkulasjon = EHC). Innholdet av hepatisk gallesalt er tett regulert på flere nivåer for å opprettholde ikke-toksiske nivåer. Transkripsjonsfaktoren Farnesoid X-reseptor (FXR) spiller en nøkkelrolle i gallesalthomeostase ved å regulere syntese, galleutskillelse, intestinalt gjenopptak og metabolisme av gallesalter. Genetisk mangel på FXR hos mus resulterer i nedsatt tarmbarrierefunksjon, dysregulert levermetabolisme og nedsatt utvinning fra kolestatisk leverskade. Gallesalter undertrykker sin egen biosyntese, og dette omfatter aktivering av FXR av gallesalter i det enterohepatiske vevet og kontrollerer transkripsjonen av Cyp7a1 i leveren (hastighetsbegrensende enzym for gallesaltsyntese). Aktivert hepatisk FXR undertrykker det syntetiske gallesaltenzymet Cyp7a1 ved å indusere ekspresjonen av Shp. På den annen side induserer aktivert FXR i ileum uttrykket av FGF19 som signaliserer til leveren om å undertrykke uttrykket av Cyp7a1. Leveren anses å være det primære målet for FGF19 da den uttrykker begge komponentene i FGF19-reseptorkomplekset (FGFR4-βklotho). Dyreeksperimenter viste en avgjørende rolle for intestinal FXR i å forhindre bakteriell overvekst og opprettholde integritet i en musemodell av obstruktiv kolestase. Dessuten forbedret intestinal FXR-aktivering kolestatisk leverskade hos gallekanalligerte mus. Dette understreker at en intakt EHC er avgjørende for å opprettholde vevshomeostase i tynntarmen og leveren.

Intraluminal bakteriell overvekst, translokasjon av mikrobielle endotoksiner, økt intestinal permeabilitet, aktivering av intestinale og hepatiske inflammatoriske kaskader og endotoksemi forekommer ofte hos pasienter med obstruktiv kolestase (f. kreft i bukspyttkjertelen og kolangiokarsinom). Fravær av galle i tarmkanalen er assosiert med disse anomaliene. Etterforskerne postulerer at normal gallestrøm hos pasienter med obstruktiv kolestase er svekket, og derfor er gallesaltsignalering svekket, noe som fører til dysregulering i enterohepatisk vev. For ytterligere å forbedre vår forståelse av gallesalt-FGF19-signalering på tvers av forskjellige abdominale organer, vil etterforskerne innhente blodprøver ikke bare fra den radiale arterien, portalen og levervenen, men også fra den øvre mesenteriske venen, den inferior mesenteriske venen, milten. vene og nyrevenen. Ved å inkludere disse blodårene vil etterforskerne kunne få informasjon om bidraget fra tynntarmen, tykktarmen, milten og nyrene, separat i produksjon eller ekstraksjon av FGF19 hos mennesker. Nemlig, arteriovenøse forskjeller (ΔAV) og netto organflukser (flow x ΔAV) tjener som et kvantitativt mål på metabolittutveksling over portalen drenert viscera (PDV), det splanchniske området og tynntarmen, tykktarmen, milten og nyrene.

Hypotesen er at FGF19 interorganfluks skifter under obstruktiv kolestase mot produksjon eller frigjøring av FGF19 av andre abdominale organer i stedet for tynntarmen. Serum FGF19-høyde og FGF19-mRNA-ekspresjon i leveren til pasienter med obstruktiv kolestase støtter dette konseptet.

Målet med denne studien er å undersøke FGF19-signalering hos pasienter med kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske pasienter ved å beregne flukser over de portaldrenerte organene. For det andre vil etterforskerne undersøke de metabolske og funksjonelle konsekvensene (glukose, lipidhomeostase, kolestatisk kløe, tarmbarrierefunksjon, gallesaltsammensetning) av en forstyrret FXR-FGF19-vei hos mennesker. Funn fra denne studien vil gi ny innsikt i enterohepatisk gallesalt-FGF19-signalering hos mennesker og kan føre til potensielle terapeutiske strategier ved kolestatiske leversykdommer.

Hovedmål

• Bestem in vivo interorganflukser av FGF19 hos pasienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske pasienter og drenerte pasienter

Sekundære mål

• Bestem organflukser av gallesalter (arter) hos pasienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske pasienter (kontrollgruppe) og drenerte pasienter (restaurert EHC-gruppe)
• Bestem genuttrykk av gener implisert i gallesalt og FGF19-signalering i enterohepatisk vev (lever, jejunum, galleblæren, vanlig gallegang, hvitt fettvev) og skjelettmuskelvev hos pasienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske pasienter (kontrollgruppe) og drenerte pasienter (restaurert EHC-gruppe).
• Bestem mikrobiota av pasienter med obstruktiv kolestase sammenlignet med ikke-kolestatiske pasienter (kontrollgruppe) og drenerte pasienter (restaurert EHC-gruppe) i preoperativ avføring og intraoperativt intraluminalt fekalt innhold.
• Bestem sammensetningen av gallesalt hos pasienter med ikke-kolestatiske pasienter (kontrollgruppe) og drenerte pasienter (restaurert EHC-gruppe) i plasma, urin og galle.
• Bestem om flukser av metabolitter (f.eks. gallesalter, FGF19) er relatert til kolestatisk kløe

Fra pasientene som deltar i studien vil i) blod, ii) vev fra reseksjonert materiale, iii) galle, iv) avføring, v) urin, vi) jejunalt innhold og vii) informasjon om alvorlighetsgraden av kløen samles inn. Siden blodårene angitt nedenfor er lett tilgjengelige hos pasienter som gjennomgår pylorus-bevarende pancreaticoduodenectomy (pp Whipple) eller leverreseksjon, er disse pasientene kvalifisert for studien og vil bli inkludert. Før blodprøvetaking vil blodstrømmen i portvenen og leverarterien måles umiddelbart med Transonic blodstrømsmåler. Blod vil bli tatt fra følgende kar:

portvene, hepatisk vene, mesenterisk vene superior, mesenterisk vene inferior, miltvene, nyrevene, radial arterie

Arteriovenøse forskjeller (ΔAV) og netto organflukser (flow x ΔAV) er et kvantitativt mål på rollen til leveren, PDV, splanchnic området, tynntarmen, tykktarmen, milten og nyrene i å produsere eller ekstrahere FGF19 og gallesalter. Fluksene vil bli beregnet ved å måle plasmanivåer av metabolitter og bestemme blodstrømmen i disse karene.

Alle pasienter som gjennomgår pp Whipple eller leverreseksjon har et arteriekateter under operasjonen som etterforskerne kan ta blodprøver fra. Nevnte årer (6x) vil bli punktert direkte med 25G nåler. 10 ml arterielt blod og 10 ml intraabdominalt blod fra de forskjellige karene hver for seg vil bli tatt en gang under operasjonen, noe som resulterer i en total blodprøve på maksimalt 70 ml. Alle blodprøver vil bli samlet i både forhåndskjølte EDTA og hepariniserte vakuumrør og sentrifugert ved 3500 rpm ved 4°C i 10 minutter. Plasma vil bli lagret i Eppendorf-kopper ved -80°C inntil videre analyse. Blodstrømmen vil bli målt ved hjelp av intraoperativ dupleks ultrasonografi.

Vev vil bli utforsket av histologi (histokjemi, immunhistokjemi/fluorescerende), og for detaljert analyse av gener involvert i gallesalt-FGF19-signalering og metabolske prosesser (f.eks. glukosehomeostase, lipidhomeostase). Følgende vev (fra reseksjonert materiale) under operasjonen vil bli samlet inn, noe som muliggjør detaljerte studier av gener som er involvert i gallesalt-FGF19-signalering i enterohepatisk vev:

leverprøve (ved leverreseksjon), galleblæreprøve, vanlig gallegangprøve, proksimal jejunalprøve (ved hepaticojejunostomi under kirurgisk prosedyre), hvitt fettvev (WAT) [subkutant, omentalt, visceralt], rectus abdominis muskel

Tidligere studie viste at menneskelig galle inneholder høye nivåer av FGF19. Den nøyaktige funksjonelle rollen til FGF19 i galle er imidlertid ikke kjent. Derfor vil galle samles opp intraoperativt for å undersøke effekten av obstruktiv kolestase på FGF19-nivåer i galle. Galle vil bli samlet ved punktering av galleblæren etter fjerning eller fra levergallegangen i tilfelle galleblæren ikke er in situ.

Tarmmikrobiotaen spiller en viktig rolle i gallesalthomeostase ved sekundær modifikasjon og dekonjugering av primære gallesalter. Den mikrobielle sammensetningen (f.eks. skift i gallesalthydrolaseproduserende bakterier) av preoperativ avføring og proksimalt jejunalt innhold under kirurgi vil bli analysert. Plasma fra de tre pasientgruppene (kontroll, drenert og kolestatisk) vil bli analysert for markører for enterocyttfunksjon (f.eks. citrullin) og enterocyttskade (f.eks. IFABP), transmural skade (SM22), endotoksiner (LBP), pro-inflammatoriske cytokiner (IL-6 og TNF-alfa) og nye markører for leverbetennelse (Cathepsin).

Kolestatisk kløe (kløe) er vanlig hos pasienter med obstruktiv kolestase. Kilden til kløe er foreløpig ukjent, og gallesalter er involvert i utviklingen av kolestatisk kløe. Derfor vil etterforskerne be pasientene om å måle kløeintensiteten deres dagen før operasjonen ved hjelp av en visuell analog skala (VAS, en skala fra 0 (ingen kløe) til 10 (verst mulig kløe)). I tillegg vil etterforskerne be dem om å fylle ut et kort spørreskjema, 5D kløeskalaen. Metabolitter involvert i kløe (f.eks. gallesalter) vil bli analysert i blodprøvene for å beregne flukser og disse vil bli korrelert med de preoperative VAS-skårene og 5D kløeskalaen.

Urin vil også bli samlet inn preoperativt fra alle pasienter for å undersøke om kolestase påvirker ruten for utskillelse av gallesalt (fra galleutskillelse til nyreutskillelse). Gallesaltsammensetning vil bli analysert i urin med væskekromatografi massespektrometri (LC-MS).

Hovedstudieparametere/endepunkter: Hovedstudieparameteren er netto organfluks av FGF19 på tvers av abdominale organer beregnet ved å måle FGF19-nivåer i humant plasma ved bruk av en enzymkoblet immuno-sorbentanalyse (ELISA) hos kolestatiske versus ikke-kolestatiske pasienter og drenerte pasienter . Menneskelig plasma vil bli innhentet under kirurgi fra 7 kar i) radial arterie, ii) mesenteric superior vene, iii) mesenteric inferior vene, iv) renal vene, v) milt vene, vi) hepatisk vene og vii) portalvene for å beregne netto organ flukser. Sekundære parametere er uttrykk for gener relatert til gallesalt og FGF19-signalering i enterohepatisk vev (lever, jejunum, galleblæren, vanlig gallegang, hvitt fettvev og skjelettmuskelvev), gener involvert i glukose- og lipidhomeostase, FGF19-nivåer i galle, tarm mikrobiota, kolestatisk kløe og gallesaltsammensetning i urin.

Arten og omfanget av byrden og risiko knyttet til deltakelse, nytte og gruppetilhørighet: Pasienter som planlegges for en Whipple-prosedyre eller leverreseksjon er inkludert. Informert samtykke innhentes enten på poliklinikk eller ved innleggelsesdagen, med en ukes tid til å bestemme. Pasientene vil da også få tid til å stille spørsmål.

Blod fra disse pasientene vil bli tatt under kirurgi under generell anestesi fra portvenen, levervenen, mesenterisk vene superior, mesenterisk vene inferior, miltvene, nyrevenen og arteria radialis. Forsøksoppsettet består av 1 gang arteriell blodprøvetaking (10ml) og 1 gang intraabdominal blodprøvetaking (6x10ml) som er maksimalt 70 ml totalt. Under operasjonen vil blodstrømmen bli målt av portvenen og leverarterien for nøyaktig å beregne organflukser. Portvenen og leverarterien er lett tilgjengelig for strømningsmåling med Transonic strømningsmåler. Denne enheten er CE-sertifisert og brukes rutinemessig for å måle faktisk blodstrøm. Det er ingen risiko forbundet med måling av disse blodstrømmene.

I tillegg vil det bli tatt prøver av galle under kirurgi (4 ml) fra galleblæren eller leverkanalen under kirurgi, og biopsier vil bli tatt fra leveren (1, ved leverreseksjon), galleblæren (1), jejunum (1, i tilfelle). av hepaticojejunostomi), felles gallegang (CBD, 1). hvitt fettvev (WAT, fra tre steder; subkutant, omentalt og visceralt fettvev) og rectus abdominis muskel for genekspresjonsstudier av gener. Dessuten vil perioperativ avføring og urin, og jejunalt innhold under kirurgi (i tilfelle hepaticojejunostomi) samles inn for detaljert analyse av mikrobiota/gallesaltsammensetning for å undersøke effekten av obstruktiv kolestase på disse parameterne. Pasienter vil bli vurdert for alvorlighetsgrad av kløe ved hjelp av et spørreskjema (visuell analog skala og 5D kløeskala) dagen før operasjonen for å korrelere flukser til kolestatisk kløe.

Metodene som er benyttet, dvs. arteriell og intraabdominal blodprøvetaking og innsamling av lever/jejunalbiopsier som del av planlagt reseksjon, er tidligere brukt uten konsekvenser for kirurgiske inngrep eller pasientene. Sammenlignet med tidligere etisk godkjente protokoller vil det tas prøver av galle (4 ml) fra galleblæren eller leverkanalen under operasjonen, og biopsier av galleblæren (1x), CBD (1x) og WAT (3x), samt avføring vil bli tatt. samlet en gang preoperativt. Det er ingen ytterligere risiko knyttet til oppsamling av galle og vev siden disse er en del av det resekerte vevet. Biopsien av tynntarmen, hvitt fettvev og rectus abdominis-muskelen vil bli tatt fra deler som skal resekseres under operasjonen eller fra det kirurgiske snittstedet, og forhindrer dermed risikoen for permanente komplikasjoner. Potensiell peroperativ blødning av vevet vil bli elektrokoagulert av kirurgen. Abdominale biopsier vil bli tatt av dyktige hepatopankreaticobiliære kirurger. Ingen ytterligere risiko er forbundet med oppsamling av preoperativ avføring og urin. Selv om resultatene av dette prosjektet ikke har noen direkte positive effekter for de involverte pasientene, bidrar de til forståelsen av rollen til gallesalter og FGF19-signalering under kolestatiske forhold. Innsikt fra denne studien vil gi nyhet og betydelig kunnskap om mulige effekter av FGF19-terapi ved kolestatisk leverskade.