FGF19 w cholestazie obturacyjnej: „Ujawnij sygnał” (FOCUS)

Ponieważ sole kwasów żółciowych są biologicznymi emulgatorami, odgrywają istotną rolę w trawieniu i wchłanianiu lipidów i witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Sole kwasów żółciowych działają również jako silne cząsteczki sygnalizacyjne ukierunkowane na receptory związane z błoną jądrową i komórkami plazmatycznymi wyczuwającymi sole kwasów żółciowych. Aktywacja tych receptorów wpływa na kilka procesów metabolicznych i biologicznych, w tym homeostazę soli żółciowych i glukozy, termogenezę, funkcję bariery jelitowej i regenerację wątroby.

Sole kwasów żółciowych są syntetyzowane w wątrobie i wydajnie zawracane do wątroby przez światło jelita i krew wrotną (krążenie jelitowo-wątrobowe = EHC). Zawartość soli żółciowych w wątrobie jest ściśle regulowana na wielu poziomach, aby utrzymać nietoksyczny poziom. Czynnik transkrypcyjny Farnesoid X Receptor (FXR) odgrywa kluczową rolę w homeostazie soli żółciowych poprzez regulację syntezy, wydalania z żółcią, wychwytu zwrotnego jelit i metabolizmu soli żółciowych. Genetyczny niedobór FXR u myszy powoduje upośledzoną funkcję bariery jelitowej, rozregulowany metabolizm wątrobowy i upośledzoną regenerację po cholestatycznym uszkodzeniu wątroby. Sole kwasów żółciowych hamują własną biosyntezę, co obejmuje aktywację FXR przez sole kwasów żółciowych w tkance jelitowo-wątrobowej i kontrolowanie transkrypcji Cyp7a1 w wątrobie (enzym ograniczający szybkość syntezy soli kwasów żółciowych). Aktywowany wątrobowy FXR hamuje syntetyczny enzym soli żółciowej Cyp7a1 przez indukcję ekspresji Shp. Z drugiej strony aktywowany FXR w jelicie krętym indukuje ekspresję FGF19, który sygnalizuje wątrobie represję ekspresji Cyp7a1. Wątroba jest uważana za główny cel FGF19, ponieważ eksprymuje ona oba składniki kompleksu FGF19-receptor (FGFR4-βklotho). Eksperymenty na zwierzętach wykazały kluczową rolę jelitowego FXR w zapobieganiu przerostowi bakterii i utrzymywaniu integralności jelit w mysim modelu cholestazy obturacyjnej. Co więcej, jelitowa aktywacja FXR łagodziła cholestatyczne uszkodzenie wątroby u myszy z podwiązanymi przewodami żółciowymi. Podkreśla to, że nienaruszona EHC ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy tkanek w jelicie cienkim i wątrobie.

Przerost bakterii w świetle jelita, translokacja endotoksyn drobnoustrojów, zwiększona przepuszczalność jelit, aktywacja kaskad zapalnych jelit i wątroby oraz endotoksemia występują często u pacjentów z cholestazą obturacyjną (np. rak trzustki i rak dróg żółciowych). Brak żółci w przewodzie pokarmowym jest związany z tymi anomaliami. Badacze postulują, że normalny przepływ żółci u pacjentów z cholestazą obturacyjną jest zaburzony, a tym samym sygnalizacja soli żółciowych jest zaburzona, co prowadzi do rozregulowania w tkankach jelitowo-wątrobowych. Aby jeszcze bardziej poprawić naszą wiedzę na temat przekazywania sygnałów przez sól żółciową-FGF19 w różnych narządach jamy brzusznej, badacze pobiorą próbki krwi nie tylko z tętnicy promieniowej, żyły wrotnej i żyły wątrobowej, ale także z żyły krezkowej górnej, żyły krezkowej dolnej, żyły śledzionowej żyła i żyła nerkowa. Uwzględniając te naczynia krwionośne, badacze będą mogli uzyskać informacje na temat udziału jelita cienkiego, okrężnicy, śledziony i nerek oddzielnie w produkcji lub ekstrakcji FGF19 u ludzi. Mianowicie, różnice tętniczo-żylne (ΔAV) i strumienie netto narządów (przepływ x ΔAV) służą jako ilościowa miara wymiany metabolitów w trzewiach z drenem wrotnym (PDV), obszarze trzewnym i jelicie cienkim, okrężnicy, śledzionie i nerkach.

Hipoteza jest taka, że ​​przepływ między narządami FGF19 przesuwa się podczas cholestazy obturacyjnej w kierunku produkcji lub uwalniania FGF19 przez inne narządy jamy brzusznej, a nie przez jelito cienkie. Podwyższony poziom FGF19 w surowicy i ekspresja mRNA FGF19 w wątrobie pacjentów z cholestazą obturacyjną potwierdzają tę koncepcję.

Celem tego badania jest zbadanie sygnalizacji FGF19 u pacjentów z cholestazą w porównaniu z pacjentami bez cholestazy poprzez obliczenie przepływów przez narządy drenowane z portalu. Po drugie, badacze zbadają metaboliczne i funkcjonalne konsekwencje (glukoza, homeostaza lipidów, świąd cholestatyczny, funkcja bariery jelitowej, skład soli kwasów żółciowych) zaburzonego szlaku FXR-FGF19 u ludzi. Wyniki tego badania dostarczą nowych informacji na temat sygnalizacji jelitowo-wątrobowej soli żółciowej-FGF19 u ludzi i mogą prowadzić do potencjalnych strategii terapeutycznych w cholestatycznych chorobach wątroby.

Podstawowy cel

• Określić in vivo międzynarządowe przepływy FGF19 u pacjentów z cholestazą obturacyjną w porównaniu z pacjentami bez cholestazy i pacjentami z drenażem

Cele drugorzędne

• Określenie przepływu soli żółciowych (gatunków) w narządach u pacjentów z cholestazą obturacyjną w porównaniu z pacjentami bez cholestazy (grupa kontrolna) i pacjentami po drenażu (grupa z przywróconą EHC)
• Określenie ekspresji genów zaangażowanych w sygnalizację soli żółciowych i FGF19 w tkankach jelitowo-wątrobowych (wątroba, jelito czcze, pęcherzyk żółciowy, przewód żółciowy wspólny, biała tkanka tłuszczowa) i tkance mięśni szkieletowych pacjentów z cholestazą obturacyjną w porównaniu z pacjentami bez cholestazy (grupa kontrolna) i drenowani (przywrócona grupa EHC).
• Określenie mikrobiomu pacjentów z cholestazą obturacyjną w porównaniu z pacjentami bez cholestazy (grupa kontrolna) i pacjentami po drenażu (grupa z przywróconą EHC) w stolcu przedoperacyjnym i śródoperacyjnej zawartości kału w świetle jelita.
• Oznaczenie składu soli kwasów żółciowych u pacjentów bez cholestazy (grupa kontrolna) i pacjentów po drenażu (grupa z przywróconą EHC) w osoczu, moczu i żółci.
• Określić, czy strumienie metabolitów (np. sole kwasów żółciowych, FGF19) są związane ze świądem cholestatycznym

Od pacjentów biorących udział w badaniu i) krew, ii) tkanka z wyciętego materiału, iii) żółć, iv) stolec, v) mocz, vi) treść jelita czczego oraz vii) zostaną zebrane informacje na temat nasilenia świądu. Ponieważ naczynia krwionośne wskazane poniżej są łatwo dostępne u pacjentów poddawanych pankreatoduodenektomii z zachowaniem odźwiernika (pp Whipple'a) lub resekcji wątroby, pacjenci ci kwalifikują się do badania i zostaną włączeni. Przed pobraniem krwi należy natychmiast zmierzyć przepływ krwi w żyle wrotnej i tętnicy wątrobowej za pomocą przepływomierza Transonic. Krew zostanie pobrana z następujących naczyń:

żyła wrotna, żyła wątrobowa, żyła krezkowa górna, żyła krezkowa dolna, żyła śledzionowa, żyła nerkowa, tętnica promieniowa

Różnice tętniczo-żylne (ΔAV) i strumienie netto narządów (przepływ x ΔAV) są ilościową miarą roli wątroby, PDV, obszaru trzewnego, jelita cienkiego, okrężnicy, śledziony i nerek w wytwarzaniu lub ekstrakcji FGF19 i soli kwasów żółciowych. Przepływy zostaną obliczone poprzez pomiar poziomów metabolitów w osoczu i określenie przepływu krwi w tych naczyniach.

Wszyscy pacjenci poddawani resekcji pp Whipple'a lub resekcji wątroby mają podczas operacji cewnik tętniczy, z którego badacze mogą pobierać krew. Wspomniane żyły (6x) zostaną nakłute bezpośrednio za pomocą igieł 25G. 10 ml krwi tętniczej i 10 ml krwi wewnątrzbrzusznej z różnych naczyń oddzielnie zostanie pobrane raz podczas zabiegu, co daje łączną ilość pobranej krwi wynoszącą maksymalnie 70 ml. Wszystkie próbki krwi zostaną zebrane zarówno do wstępnie schłodzonych EDTA, jak i heparynizowanych probówek próżniowych i odwirowane przy 3500 obr./min w 4°C przez 10 minut. Osocze będzie przechowywane w kubkach Eppendorfa w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. Przepływ krwi będzie mierzony za pomocą śródoperacyjnej ultrasonografii Duplex.

Tkanki zostaną zbadane histologicznie (histochemicznie, immunohistochemicznie/fluorescencyjnie) oraz w celu szczegółowej analizy genów związanych z sygnalizacją i procesami metabolicznymi soli żółciowej-FGF19 (np. homeostaza glukozy, homeostaza lipidów). Następujące tkanki (z wyciętego materiału) zostaną pobrane podczas zabiegu chirurgicznego, co umożliwi szczegółowe badanie genów zaangażowanych w sygnalizację soli żółciowej-FGF19 w tkankach jelitowo-wątrobowych:

wycinek wątroby (w przypadku resekcji wątroby), wymaz z pęcherzyka żółciowego, wykrój z przewodu żółciowego wspólnego, wykrój z bliższej części jelita czczego (w przypadku hepatojejunostomii podczas zabiegu), biała tkanka tłuszczowa (WAT) [podskórna, sieciowa, trzewna], mięsień prosty brzucha

Poprzednie badanie wykazało, że ludzka żółć zawiera duże ilości FGF19. Jednak dokładna funkcjonalna rola FGF19 w żółci nie jest znana. Dlatego żółć zostanie pobrana śródoperacyjnie w celu zbadania wpływu cholestazy obturacyjnej na poziomy FGF19 w żółci. Żółć zostanie pobrana przez nakłucie pęcherzyka żółciowego po jego usunięciu lub z wątrobowego przewodu żółciowego, jeśli pęcherzyk żółciowy nie jest in situ.

Mikroflora jelitowa odgrywa główną rolę w homeostazie soli żółciowych poprzez wtórną modyfikację i dekoniugację pierwotnych soli żółciowych. Skład mikrobiologiczny (np. przesunięcie w bakteriach wytwarzających hydrolazę soli żółciowych) przedoperacyjnego stolca i proksymalnej treści jelita czczego podczas operacji zostaną przeanalizowane. Osocze z trzech grup pacjentów (kontrolnej, drenowanej i cholestatycznej) będzie analizowane pod kątem markerów czynności enterocytów (np. cytrulina) i uszkodzenia enterocytów (np. IFABP), uszkodzeń przezściennych (SM22), endotoksyn (LBP), cytokin prozapalnych (IL-6 i TNF-alfa) oraz nowych markerów zapalenia wątroby (kathepsyna).

Świąd cholestatyczny (swędzenie) jest częsty u pacjentów z cholestazą obturacyjną. Źródło swędzenia jest obecnie nieznane, a sole kwasów żółciowych są zaangażowane w rozwój świądu cholestatycznego. Dlatego badacze chcieliby poprosić pacjentów o ocenę intensywności swędzenia w dniu poprzedzającym operację za pomocą Wizualnej Skali Analogowej (VAS, skala od 0 (brak swędzenia) do 10 (najgorszy możliwy świąd)). Ponadto badacze poproszą ich o wypełnienie krótkiego kwestionariusza, 5-wymiarowej skali świądu. Metabolity biorące udział w swędzeniu (np. sole kwasów żółciowych) zostaną przeanalizowane w próbkach krwi w celu obliczenia przepływów, które zostaną skorelowane z przedoperacyjnymi wynikami VAS i 5D skalą świądu.

Przed operacją zostanie również pobrany mocz od wszystkich pacjentów w celu zbadania, czy cholestaza wpływa na drogę wydalania soli żółciowych (od wydalania z żółcią do wydalania przez nerki). Skład soli kwasów żółciowych będzie analizowany w moczu metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS).

Główne parametry badania/punkty końcowe: Głównym parametrem badania jest przepływ netto FGF19 przez narządy jamy brzusznej, obliczony na podstawie pomiaru poziomu FGF19 w ludzkim osoczu za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) u pacjentów z cholestazą i bez cholestazy oraz pacjentów po drenowaniu. . Ludzkie osocze zostanie pobrane podczas operacji z 7 naczyń i) tętnica promieniowa, ii) żyła krezkowa górna, iii) żyła krezkowa dolna, iv) żyła nerkowa, v) żyła śledzionowa, vi) żyła wątrobowa i vii) żyła wrotna do obliczenia netto narządu strumienie. Drugorzędowymi parametrami są ekspresja genów związanych z sygnalizacją soli żółciowych i FGF19 w tkankach jelitowo-wątrobowych (wątroba, jelito czcze, pęcherzyk żółciowy, przewód żółciowy wspólny, biała tkanka tłuszczowa i tkanka mięśni szkieletowych), geny zaangażowane w homeostazę glukozy i lipidów, poziomy FGF19 w żółci, jelicie Mikrobiom, świąd cholestatyczny i skład soli żółciowych w moczu.

Charakter i zakres obciążenia i ryzyka związanego z uczestnictwem, korzyściami i powiązaniem z grupą: Uwzględniono pacjentów planowanych do zabiegu Whipple'a lub resekcji wątroby. Świadoma zgoda zostanie uzyskana w oddziale ambulatoryjnym lub w dniu przyjęcia, z tygodniowym terminem na podjęcie decyzji. Pacjenci będą mieli wtedy również czas na zadawanie pytań.

Krew od tych pacjentów zostanie pobrana podczas operacji w znieczuleniu ogólnym z żyły wrotnej, żyły wątrobowej, żyły krezkowej górnej, żyły krezkowej dolnej, żyły śledzionowej, żyły nerkowej i tętnicy promieniowej. Układ doświadczalny składa się z 1-krotnego pobrania krwi tętniczej (10 ml) i 1-krotnego pobrania krwi z jamy brzusznej (6 x 10 ml), co łącznie daje maksymalnie 70 ml. Podczas operacji zostanie zmierzony przepływ krwi w żyle wrotnej i tętnicy wątrobowej, aby precyzyjnie obliczyć przepływy w narządach. Żyła wrotna i tętnica wątrobowa są łatwo dostępne do pomiaru przepływu za pomocą przepływomierza Transonic. To urządzenie ma certyfikat CE i jest rutynowo używane do pomiaru rzeczywistego przepływu krwi. Z pomiarem tych przepływów krwi nie wiąże się żadne ryzyko.

Dodatkowo podczas zabiegu zostanie pobrana żółć (4 ml) z pęcherzyka żółciowego lub przewodu wątrobowego podczas zabiegu oraz biopsje wątroby (1 w przypadku resekcji wątroby), pęcherzyka żółciowego (1), jelita czczego (1 w przypadku resekcji wątroby) hepatojejunostomii), przewód żółciowy wspólny (CBD, 1). biała tkanka tłuszczowa (WAT, z trzech miejsc; tkanka tłuszczowa podskórna, sieciowa i trzewna) oraz mięsień prosty brzucha do badań ekspresji genów. Ponadto podczas operacji (w przypadku hepatojejunostomii) zostanie pobrany okołooperacyjny stolec i mocz oraz zawartość jelita czczego w celu szczegółowej analizy składu mikrobiomu/soli żółciowych w celu zbadania wpływu cholestazy obturacyjnej na te parametry. Pacjenci będą oceniani pod kątem nasilenia świądu za pomocą kwestionariusza (wizualna skala analogowa i skala świądu 5D) na dzień przed operacją, aby skorelować przepływy ze świądem cholestatycznym.

Stosowane metody, tj. pobieranie krwi tętniczej i śródbrzusznej oraz pobieranie biopsji wątroby/jelita czczego w ramach planowej resekcji, były dotychczas stosowane bez żadnych konsekwencji dla zabiegów operacyjnych i pacjentów. W porównaniu do wcześniej zatwierdzonych protokołów etycznych, podczas operacji zostanie pobrana żółć (4 ml) z pęcherzyka żółciowego lub przewodu wątrobowego, a biopsje pęcherzyka żółciowego (1x), CBD (1x) i WAT (3x) oraz kał zostaną pobierane jednorazowo przed operacją. Nie ma dodatkowego ryzyka związanego z pobieraniem żółci i tkanek, ponieważ są one częścią wycinanych tkanek. Biopsja jelita cienkiego, białej tkanki tłuszczowej i mięśnia prostego brzucha zostanie pobrana z części, które zostaną usunięte podczas operacji lub z miejsca nacięcia chirurgicznego, co pozwoli uniknąć ryzyka trwałych powikłań. Ewentualne okołooperacyjne krwawienie z tkanki zostanie poddane elektrokoagulacji przez chirurga. Biopsje jamy brzusznej będą wykonywane przez wykwalifikowanych chirurgów wątroby i dróg żółciowych. Żadne dodatkowe ryzyko nie wiąże się z pobraniem stolca i moczu przed operacją. Chociaż wyniki tego projektu nie mają bezpośredniego pozytywnego wpływu na zaangażowanych pacjentów, przyczyniają się one do zrozumienia roli soli kwasów żółciowych i sygnalizacji FGF19 w warunkach cholestatycznych. Spostrzeżenia z tego badania dostarczyłyby nowości i istotnej wiedzy na temat możliwych skutków terapii FGF19 w cholestatycznym uszkodzeniu wątroby.