FGF19 in obstructieve cholestase: "onthul het signaal" (FOCUS)

Omdat galzouten biologische emulgatoren zijn, spelen ze een essentiële rol bij de vertering en opname van voedingslipiden en in vet oplosbare vitamines. Galzouten werken ook als krachtige signaalmoleculen die zich richten op galzoutgevoelige nucleaire en plasmacelmembraangebonden receptoren. Verschillende metabole en biologische processen worden beïnvloed door activering van deze receptoren, waaronder galzout- en glucosehomeostase, thermogenese, darmbarrièrefunctie en leverregeneratie.

Galzouten worden gesynthetiseerd in de lever en efficiënt teruggevoerd naar de lever via het darmlumen en portaalbloed (enterohepatische circulatie = EHC). Het galzoutgehalte in de lever wordt strak gereguleerd op meerdere niveaus om niet-toxische niveaus te behouden. De transcriptiefactor Farnesoid X Receptor (FXR) speelt een sleutelrol in de galzouthomeostase door de synthese, galuitscheiding, heropname in de darm en het metabolisme van galzouten te reguleren. Genetische deficiëntie van FXR bij muizen resulteert in een verminderde darmbarrièrefunctie, een ontregeld levermetabolisme en een verminderd herstel van cholestatische leverbeschadiging. Galzouten onderdrukken hun eigen biosynthese, en dit omvat activering van FXR door galzouten in het enterohepatische weefsel en het regelen van de transcriptie van Cyp7a1 in de lever (snelheidsbeperkend enzym van galzoutsynthese). Geactiveerde hepatische FXR onderdrukt het galzout-synthetische enzym Cyp7a1 door de expressie van Shp te induceren. Aan de andere kant induceert geactiveerde FXR in het ileum de expressie van FGF19, wat de lever signaleert om de expressie van Cyp7a1 te onderdrukken. De lever wordt beschouwd als het primaire doelwit van FGF19, aangezien deze beide componenten van het FGF19-receptorcomplex (FGFR4-βklotho) tot expressie brengt. Dierexperimenten toonden een cruciale rol aan van intestinale FXR bij het voorkomen van bacteriële overgroei en het handhaven van de darmintegriteit in een muismodel van obstructieve cholestase. Bovendien verbeterde intestinale FXR-activering cholestatische leverbeschadiging bij galweg-afgebonden muizen. Dit benadrukt dat een intact EHC cruciaal is om weefselhomeostase in de dunne darm en de lever te behouden.

Intraluminale bacteriële overgroei, translocatie van microbiële endotoxinen, verhoogde darmpermeabiliteit, activering van intestinale en hepatische inflammatoire cascades en endotoxemie komen vaak voor bij patiënten met obstructieve cholestase (bijv. alvleesklierkanker en cholangiocarcinoom). Afwezigheid van gal in het darmkanaal wordt in verband gebracht met deze anomalieën. De onderzoekers veronderstellen dat de normale galstroom bij patiënten met obstructieve cholestase verstoord is en dat daarom de galzoutsignalering verstoord is, wat leidt tot ontregeling in enterohepatische weefsels. Om ons begrip van galzout-FGF19-signalering in verschillende buikorganen verder te verbeteren, zullen de onderzoekers bloedmonsters nemen, niet alleen van de radiale slagader, het portaal en de leverader, maar ook van de superieure mesenteriale ader, inferieure mesenteriale ader, de milt ader en de nierader. Door deze bloedvaten mee te nemen, kunnen de onderzoekers informatie verkrijgen over de bijdrage van de dunne darm, de dikke darm, de milt en de nieren, afzonderlijk bij de aanmaak of extractie van FGF19 bij de mens. Arterioveneuze verschillen (ΔAV) en netto orgaanfluxen (flow x ΔAV) dienen namelijk als een kwantitatieve maat voor de uitwisseling van metabolieten door de door het portaal gedraineerde ingewanden (PDV), het splanchnische gebied en de dunne darm, colon, milt en nieren.

De hypothese is dat de flux van FGF19 tussen organen tijdens obstructieve cholestase verschuift naar productie of afgifte van FGF19 door andere buikorganen in plaats van door de dunne darm. Serum FGF19-verhoging en FGF19-mRNA-expressie in de lever van patiënten met obstructieve cholestase ondersteunen dit concept.

Het doel van deze studie is om FGF19-signalering bij patiënten met cholestase te onderzoeken in vergelijking met niet-cholestatische patiënten door fluxen over de portale gedraineerde organen te berekenen. Ten tweede zullen de onderzoekers de metabole en functionele gevolgen (glucose, lipidehomeostase, cholestatische jeuk, darmbarrièrefunctie, galzoutsamenstelling) van een verstoorde FXR-FGF19-route bij mensen onderzoeken. Bevindingen van deze studie zullen nieuwe inzichten verschaffen in enterohepatische galzout-FGF19-signalering bij mensen en kunnen leiden tot mogelijke therapeutische strategieën bij cholestatische leverziekten.

Hoofddoel

• Bepaal in vivo interorgaanfluxen van FGF19 bij patiënten met obstructieve cholestase in vergelijking met niet-cholestatische patiënten en gedraineerde patiënten

Secundaire doelstellingen

• Bepaal orgaanfluxen van galzouten (soort) bij patiënten met obstructieve cholestase in vergelijking met niet-cholestatische patiënten (controlegroep) en uitgelekte patiënten (herstelde EHC-groep)
• Genexpressie bepalen van genen die betrokken zijn bij galzout en FGF19-signalering in enterohepatische weefsels (lever, jejunum, galblaas, galkanaal, wit vetweefsel) en skeletspierweefsel van patiënten met obstructieve cholestase in vergelijking met niet-cholestatische patiënten (controlegroep) en gedraineerde patiënten (herstelde EHC-groep).
• Bepaal de microbiota van patiënten met obstructieve cholestase in vergelijking met niet-cholestatische patiënten (controlegroep) en gedraineerde patiënten (herstelde EHC-groep) in preoperatieve ontlasting en intraoperatieve intraluminale fecale inhoud.
• Bepaal de galzoutsamenstelling bij patiënten met niet-cholestatische patiënten (controlegroep) en gedraineerde patiënten (herstelde EHC-groep) in plasma, urine en gal.
• Bepaal of fluxen van metabolieten (bijv. galzouten, FGF19) zijn gerelateerd aan cholestatische jeuk

Van de patiënten die deelnemen aan het onderzoek wordt i) bloed, ii) weefsel van gereseceerd materiaal, iii) gal, iv) ontlasting, v) urine, vi) jejunale inhoud en vii) informatie over de ernst van de jeuk verzameld. Aangezien de hieronder aangegeven bloedvaten gemakkelijk toegankelijk zijn bij patiënten die een pylorussparende pancreaticoduodenectomie (pp Whipple) of leverresectie ondergaan, komen deze patiënten in aanmerking voor de studie en zullen ze worden opgenomen. Voorafgaand aan de bloedafname wordt direct de doorbloeding van de poortader en leverslagader gemeten met de Transonic bloedstroommeter. Bloed zal worden bemonsterd uit de volgende vaten:

poortader, leverader, superieure mesenteriale ader, inferieure mesenteriale ader, miltader, nierader, radiale slagader

Arterioveneuze verschillen (ΔAV) en netto orgaanfluxen (flow x ΔAV) zijn een kwantitatieve maat voor de rol van de lever, PDV, het splanchnische gebied, dunne darm, colon, milt en de nieren bij het produceren of extraheren van FGF19 en galzouten. De fluxen zullen worden berekend door de plasmaspiegels van metabolieten te meten en de bloedstroom in deze vaten te bepalen.

Alle patiënten die een pp Whipple of leverresectie ondergaan, hebben tijdens de operatie een arteriële katheter waaruit de onderzoekers bloed kunnen afnemen. De genoemde aders (6x) worden direct aangeprikt met 25G naalden. Tijdens de operatie wordt eenmalig 10 ml arterieel bloed en 10 ml intra-abdominaal bloed uit de verschillende vaten afzonderlijk afgenomen, zodat de totale hoeveelheid afgenomen bloed maximaal 70 ml bedraagt. Alle bloedmonsters worden verzameld in zowel voorgekoelde EDTA- als gehepariniseerde vacuümbuizen en gedurende 10 minuten bij 3500 rpm bij 4°C gecentrifugeerd. Plasma wordt bewaard in Eppendorf-bekers bij -80°C tot verdere analyse. De bloedstroom zal worden gemeten met behulp van intra-operatieve duplex-echografie.

Weefsels zullen worden onderzocht door middel van histologie (histochemie, immunohistochemie/fluorescentie), en voor gedetailleerde analyse van genen die betrokken zijn bij galzout-FGF19-signalering en metabolische processen (bijv. glucosehomeostase, lipidehomeostase). De volgende weefsels (van gereseceerd materiaal) zullen tijdens de operatie worden verzameld, wat een gedetailleerde studie mogelijk maakt van genen die betrokken zijn bij galzout-FGF19-signalering in enterohepatische weefsels:

levermonster (in geval van leverresectie), galblaasmonster, monster van de galwegen, proximaal jejunaal monster (in geval van hepaticojejunostomie tijdens chirurgische ingreep), wit vetweefsel (WAT) [subcutaan, omentaal, visceraal], rectus abdominis-spier

Vorige studie toonde aan dat menselijke gal hoge niveaus van FGF19 bevat. De exacte functionele rol van FGF19 in gal is echter niet bekend. Daarom zal intra-operatief gal worden verzameld om het effect van obstructieve cholestase op FGF19-spiegels in gal te onderzoeken. Gal zal worden opgevangen door punctie van de galblaas na verwijdering of uit de levergalgang als de galblaas niet in situ is.

De darmmicrobiota speelt een belangrijke rol in de homeostase van galzouten door secundaire modificatie en deconjugatie van primaire galzouten. De microbiële samenstelling (bijv. verschuiving in galzouthydrolase producerende bacteriën) van preoperatieve ontlasting en proximale jejunale inhoud tijdens chirurgie zal worden geanalyseerd. Plasma van de drie patiëntengroepen (controle, gedraineerd en cholestatisch) zal worden geanalyseerd op markers van enterocytenfunctie (bijv. citrulline) en enterocytschade (bijv. IFABP), transmurale schade (SM22), endotoxinen (LBP), pro-inflammatoire cytokines (IL-6 en TNF-alpha) en nieuwe markers voor leverontsteking (Cathepsin).

Cholestatische pruritis (jeuk) komt vaak voor bij patiënten met obstructieve cholestase. De bron van jeuk is momenteel onbekend en galzouten zijn betrokken bij de ontwikkeling van cholestatische jeuk. Daarom willen de onderzoekers de patiënten vragen om hun jeukintensiteit op de dag voor de operatie te scoren door middel van een Visual Analogue Scale (VAS, een schaal van 0 (geen jeuk) tot 10 (ergste jeuk mogelijk)). Daarnaast zullen de onderzoekers hen vragen een korte vragenlijst in te vullen, de 5D jeukschaal. Metabolieten betrokken bij jeuk (bijv. galzouten) worden geanalyseerd in de bloedmonsters om fluxen te berekenen en deze worden gecorreleerd met de preoperatieve VAS-scores en 5D jeukschaal.

Ook zal van alle patiënten preoperatief urine worden verzameld om te onderzoeken of cholestase invloed heeft op de route van galzoutuitscheiding (van galuitscheiding naar nieruitscheiding). De samenstelling van de galzouten zal in urine worden geanalyseerd met vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS).

Hoofdonderzoeksparameters/eindpunten: De hoofdonderzoeksparameter is de netto orgaanflux van FGF19 door de buikorganen, berekend door het meten van FGF19-spiegels in humaan plasma met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) bij cholestatische versus niet-cholestatische patiënten en gedraineerde patiënten. . Menselijk plasma zal tijdens de operatie worden verkregen uit 7 vaten i) radiale slagader, ii) mesenteriale superieure ader, iii) mesenteriale inferieure ader, iv) nierader, v) miltader, vi) leverader en vii) poortader om het netto orgaan te berekenen stromen. Secundaire parameters zijn expressie van genen gerelateerd aan galzout en FGF19-signalering in enterohepatische weefsels (lever, jejunum, galblaas, galkanaal, wit vetweefsel en skeletspierweefsel), genen betrokken bij glucose- en lipidenhomeostase, FGF19-spiegels in gal, darm microbiota, cholestatische jeuk en galzoutsamenstelling in de urine.

Aard en omvang van de belasting en risico's verbonden aan deelname, voordeel en groepsgerelateerdheid: Patiënten die gepland zijn voor een Whipple-procedure of leverresectie zijn inbegrepen. Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen op de polikliniek of op de dag van opname, met een tijd van een week om te beslissen. Patiënten krijgen dan ook de tijd om vragen te stellen.

Bloed van deze patiënten zal worden bemonsterd tijdens de operatie onder algemene anesthesie van de poortader, leverader, superieure mesenteriale ader, inferieure mesenteriale ader, miltader, nierader en de radiale slagader. De proefopstelling bestaat uit 1 keer arteriële bloedafname (10 ml) en 1 keer intra-abdominale bloedafname (6x10 ml) van in totaal maximaal 70 ml. Tijdens de operatie wordt de bloedstroom van de poortader en de leverslagader gemeten om de orgaanfluxen nauwkeurig te berekenen. De poortader en de leverslagader zijn gemakkelijk toegankelijk voor flowmeting met de Transonic flowmeter. Dit apparaat is CE-gecertificeerd en wordt routinematig gebruikt om de werkelijke bloedstroom te meten. Aan het meten van deze bloedstromen zijn geen risico's verbonden.

Daarnaast wordt tijdens de operatie gal afgenomen (4 ml) uit de galblaas of het leverkanaal tijdens de operatie, en worden er biopsieën genomen van de lever (1, in geval van leverresectie), galblaas (1), jejunum (1, in geval van leverresectie), van hepaticojejunostomie), galkanaal (CBD, 1). wit vetweefsel (WAT, van drie locaties; subcutaan, omentaal en visceraal vetweefsel) en rectus abdominis-spier voor genexpressiestudies van genen. Bovendien zullen perioperatieve ontlasting en urine, en jejunale inhoud tijdens chirurgie (in geval van hepaticojejunostomie) worden verzameld voor gedetailleerde analyse van de microbiota/galzoutsamenstelling om het effect van obstructieve cholestase op deze parameters te onderzoeken. Patiënten zullen worden beoordeeld op de ernst van jeuk door middel van een vragenlijst (visuele analoge schaal en 5D jeukschaal) op de dag vóór de operatie om fluxen te correleren met cholestatische jeuk.

De toegepaste methoden, d.w.z. arteriële en intra-abdominale bloedafname en het nemen van lever-/jejunale biopsieën als onderdeel van geplande resectie, zijn eerder gebruikt zonder enige gevolgen voor de chirurgische procedures of de patiënten. In vergelijking met eerder ethisch goedgekeurde protocollen, zal er tijdens de operatie gal (4 ml) uit de galblaas of het leverkanaal worden afgenomen, en biopsies van de galblaas (1x), CBD (1x) en WAT (3x), evenals ontlasting. één keer preoperatief verzameld. Er zijn geen extra risico's verbonden aan het verzamelen van gal en weefsels, aangezien deze deel uitmaken van de gereseceerde weefsels. De biopsie van de dunne darm, het witte vetweefsel en de rectus abdominis-spier wordt genomen van delen die tijdens de operatie worden weggesneden of van de plaats van de chirurgische incisie, waardoor het risico op blijvende complicaties wordt voorkomen. Mogelijke peroperatieve bloedingen van het weefsel worden door de chirurg geëlektrocoaguleerd. Abdominale biopsieën zullen worden genomen door bekwame hepatopancreaticobiliaire chirurgen. Er is geen verder risico verbonden aan het verzamelen van preoperatieve ontlasting en urine. Hoewel de resultaten van dit project geen directe positieve effecten hebben voor de betrokken patiënten, dragen ze wel bij tot het begrip van de rol van galzouten en FGF19-signalering onder cholestatische omstandigheden. Inzichten uit deze studie zouden nieuwheid en substantiële kennis opleveren over mogelijke effecten van FGF19-therapie bij cholestatische leverbeschadiging.