Předpověď výsledků a personalizovaná radioterapie pomocí biomarkerů a funkčního zobrazování

Jedná se o monocentrickou, explorativní experimentální studii na tkáních (periferní krev), a proto byl plánován zápis omezeného počtu pacientů. Výsledky získané ze studie by neměly být považovány za průkazné, ale spíše za generátory výzkumných hypotéz pro případné následné studie, které mají být provedeny na větších populacích. Popisně budou analyzovány kvalitativní a kvantitativní charakteristiky vezikul a jejich obsah miRNA.

Primární cíl bude považován za dosažený, pokud hodnoty CD69+ vezikul > 349 absolutních jednotek správně predikují odpověď na radioterapii alespoň u 80 % pacientů. Následně se vyšetřovatelé snaží ověřit, zda vezikuly CD86+ > 10 absolutních jednotek a CD3+ > 4 absolutní jednotky správně predikují odpověď na radioterapii alespoň v 80 % případů. Kromě toho bude testována souvislost mezi hodnotami tří uvedených vezikul (původních i dichotomizovaných jako nad nebo pod specifikovanými hraničními hodnotami, odvozenými z předběžných výsledků naší výzkumné skupiny) a dobou do recidivy onemocnění po dvou letech.

Pacienti budou léčeni v souladu s klinickou praxí v souladu s úsudkem lékaře a informacemi uvedenými v technickém listu každého jednotlivého produktu jakékoli souběžné terapie podávané podle klinické praxe. Diagnosticko-terapeutická cesta pacientů nebude žádným způsobem ovlivněna výsledky tkáňových testů provedených pro studii.

Vyšetření TC-PET, jako součást normálního diagnosticko-terapeutického procesu, bude prováděno na jednotce nukleární medicíny Univerzitní nemocnice IRCCS v Bologni. Molekulární výzkumy budou prováděny v laboratoři Imunogenetické a transplantační biologické jednotky (IBT) přidružené k IRCCS univerzitní nemocnici v Bologni, poliklinika S. Orsola. Studie je zaměřena na pacienty podstupující neoadjuvantní RT pro lokálně pokročilé nádory rekta do jednoho roku. Zahájení studie se předpokládá 1. 5. 2023, v každém případě až po schválení etickou komisí a následném uvolnění oprávnění společnosti.

Pacienti budou zařazeni během první návštěvy na radioterapeutické jednotce Univerzitní nemocnice IRCCS v Bologni před odběrem vzorků nezbytným pro analýzy konkrétní studie. Je třeba poznamenat, že výzkumy celkové kvantifikace DNA a epigenetických změn (methylace a exprese miRNA) nezahrnují sekvenování genomu. Molekuly DNA budou zkoumány bez uvážení individuální specifičnosti; proto genetický kód jedince zůstává po vyšetření neznámý. Od každého pacienta bude odebrán vzorek 10 ml žilní krve pomocí vakuového kontejneru s EDTA a pro každý experimentální bod bude odebrána plazma. Biologické vzorky budou pseudonymizovány a označeny progresivním číslem RT/NEO/00N. Všechny vzorky budou až do použití skladovány ve speciálně označených RT nádobách v uzamčeném mrazáku umístěném v laboratoři IBT. Přeprava bude prováděna pomocí utěsněného a teplotně řízeného vyhrazeného kontejneru pracovníky zapojenými do projektu.

U každého pacienta budou analyzovány tři vzorky: 1. vzorek: 1-5 dní před začátkem RT, 2. vzorek: na konci 3. týdne RT, 3. vzorek: poslední den RT. Očekává se tedy, že bude analyzováno celkem 90 vzorků.

Izolace nanovesikul: vzorky plazmy budou zpracovány pro separaci extracelulárních vezikul pomocí kolonové gelové ultrafiltrace se sterilizovanou a pufrovanou pryskyřicí CL-B4. Nanovezikuly budou poté zpracovány pro fenotypovou analýzu pomocí soupravy Miltenyi MACSPEX a zpracovány pro extrakci DNA/RNA pomocí soupravy Nucleo Spin Tissue (Macherey Nagel, M-Medical, Milán, Itálie). Postup bude proveden v IBT laboratoři Fakultní nemocnice IRCCS v Bologni.

Epigenetická analýza:

• Analýza mikroRNA Vzorky RNA extrahované z extracelulárních vezikul budou analyzovány na obsah mikroRNA pomocí Droplet Digital PCR v laboratoři IBT.
• Methylační analýza Analýza metylačního profilu DNA jaderných krvinek bude provedena pomocí hmotnostní spektrometrie provedené na platformě Sequenom a protokolu EpiTyper (Sequenom) v laboratoři IBT Fakultní nemocnice IRCCS v Bologni. Veškeré statistické analýzy budou prováděny na jednotce IBT.

Návštěvy, hodnocení a systémové a lokální léčby budou prováděny v souladu s klinickou praxí a nebudou pro tuto studii měněny. Kromě rutinních vzorků odebraných během léčby a sledování pacienta budou odebírány alikvoty periferní krve potřebné pro analýzy specifické studie za použití stejného žilního vstupu. Konkrétně budou vzorky odebírány na začátku radioterapie, tři týdny po jejím zahájení a na konci v rámci vyšetření a návštěv naplánovaných běžnou klinickou praxí.

Při první návštěvě budou dle klinické praxe shromážděny informace související s klinickou anamnézou pacienta (onkologická anamnéza, vzdálená patologická anamnéza, farmakologická anamnéza, rodinná anamnéza). Bude provedeno celkové fyzikální vyšetření a naplánována dráha radioterapie. Bude posouzena způsobilost pacienta pro studii PROPER, a pokud bude kladná, bude získán informovaný souhlas.

Metodika analýzy:

Demografické a klinické charakteristiky pacientů budou popsány pomocí mediánu a interkvartilního rozmezí (pro spojité proměnné) a absolutních četností a procent (pro kategorické proměnné).

Vyhodnocení prediktivní schopnosti vezikul bude provedeno pomocí analýzy citlivosti a specificity předdefinovaných hraničních hodnot (CD69+ > 349 absolutních jednotek; CD86+ > 10 absolutních jednotek; CD3+ > 4 absolutní jednotky), aby se ověřilo, že všechny mají pozitivní prediktivní hodnotu ( PPV) > 80 %. Bude také provedena analýza ROC s použitím původních hodnot vezikul, aby se identifikovaly jakékoli alternativní hraniční hodnoty, které mohou lépe rozlišit výsledek.

Analýza přežití bez onemocnění po dvou letech od zahájení terapie bude provedena deskriptivně pomocí Kaplan-Meierových křivek a log-rank testu. Pacienti, kteří zemřeli v důsledku fatálních komplikací, budou k datu úmrtí cenzurováni. Vzhledem k malé velikosti studované populace lze provádět Coxovy regrese, včetně ukazatele, zda byla jako rizikový faktor překročena mezní hodnota vezikulárních onemocnění, spolu s maximálně jedním zmateným faktorem, za předpokladu, že počet příhod (recidiv onemocnění) je adekvátní. pro analýzu.