Predicción de resultados y radioterapia personalizada mediante biomarcadores e imágenes funcionales

Se trata de un estudio experimental exploratorio, monocéntrico, sobre tejidos (sangre periférica), por lo que se ha previsto la inscripción de un número limitado de pacientes. Los resultados obtenidos del estudio no deben considerarse concluyentes sino más bien generadores de hipótesis de investigación para posibles estudios posteriores a realizar en poblaciones más grandes. Se analizarán descriptivamente las características cualitativas y cuantitativas de las vesículas y su contenido de miARN.

El objetivo principal se considerará alcanzado si valores de vesículas CD69+ > 349 unidades absolutas predicen correctamente la respuesta a la radioterapia en al menos el 80% de los pacientes. Posteriormente, los investigadores pretenden verificar si las vesículas CD86+ > 10 unidades absolutas y CD3+ > 4 unidades absolutas predicen correctamente la respuesta a la radioterapia en al menos el 80% de los casos. Además, se probará la asociación entre los valores de las tres vesículas indicadas (tanto originales como dicotomizadas por encima o por debajo de los límites especificados, derivados de resultados preliminares de nuestro grupo de investigación) y el tiempo hasta la recurrencia de la enfermedad a los dos años.

Los pacientes serán tratados según la práctica clínica de acuerdo con el criterio del médico y la información proporcionada en la Ficha Técnica de cada producto individual de cualquier terapia concomitante administrada según la práctica clínica. La vía diagnóstico-terapéutica de los pacientes no se verá influenciada de ninguna manera por los resultados de las pruebas tisulares realizadas para el estudio.

Las investigaciones TC-PET, como parte del proceso diagnóstico-terapéutico normal, se realizarán en la Unidad de Medicina Nuclear del Hospital Universitario IRCCS de Bolonia. Las investigaciones moleculares se llevarán a cabo en el laboratorio de la Unidad de Inmunogenética y Biología de Trasplantes (IBT) adscrita al Hospital Universitario IRCCS de Bolonia, Policlínico S. Orsola. El estudio está dirigido a pacientes sometidos a RT neoadyuvante por tumores rectales localmente avanzados en el plazo de un año. Se espera que el estudio comience el 05/01/2023 y, en cualquier caso, sólo después de la aprobación del Comité de Ética y la posterior liberación de la autorización de la empresa.

Los pacientes se inscribirán durante la primera visita a la Unidad de Radioterapia del Hospital Universitario IRCCS de Bolonia, antes de cualquier muestreo necesario para los análisis específicos del estudio. Cabe señalar que las investigaciones sobre la cuantificación total del ADN y los cambios epigenéticos (metilación y expresión de miARN) no implican la secuenciación del genoma. Las moléculas de ADN se examinarán sin considerar la especificidad individual; por lo tanto, el código genético del individuo sigue siendo desconocido después del examen. Se recolectará una muestra de 10 ml de sangre venosa mediante un vacutainer con EDTA de cada paciente y se recolectará plasma para cada punto experimental. Las muestras biológicas serán seudonimizadas y etiquetadas con el número progresivo RT/NEO/00N. Todas las muestras se almacenarán en contenedores RT especialmente marcados en un congelador cerrado con llave ubicado en el laboratorio de IBT hasta su uso. El transporte se realizará mediante un contenedor exclusivo sellado y con temperatura controlada por el personal involucrado en el proyecto.

Se analizarán tres muestras por paciente: 1.ª muestra: 1-5 días antes del inicio de la RT, 2.ª muestra: al final de la 3.ª semana de RT, 3.ª muestra: el último día de RT. Por tanto, se espera analizar un total de 90 muestras.

Aislamiento de Nanovesículas: las muestras de plasma se procesarán para la separación de vesículas extracelulares mediante ultrafiltración en columna de gel con resina CL-B4 esterilizada y tamponada. Luego, las nanovesículas se procesarán para el análisis fenotípico utilizando el kit Miltenyi MACSPEX y se procesarán para la extracción de ADN/ARN utilizando el kit Nucleo Spin Tissue (Macherey Nagel, M-Medical, Milán, Italia). El procedimiento se llevará a cabo en el laboratorio IBT del Hospital Universitario IRCCS de Bolonia.

Análisis epigenético:

• Análisis de microARN Las muestras de ARN extraídas de las vesículas extracelulares se analizarán para determinar el contenido de microARN mediante Droplet Digital PCR en el laboratorio de IBT.
• Análisis de metilación El análisis del perfil de metilación del ADN de las células sanguíneas nucleadas se realizará mediante espectrometría de masas realizada en la plataforma Sequenom y el protocolo EpiTyper (Sequenom) en el laboratorio IBT del Hospital Universitario IRCCS de Bolonia. Todos los análisis estadísticos se realizarán en la unidad IBT.

Las visitas, valoraciones y tratamientos sistémicos y locales se realizarán según la práctica clínica y no se verán alterados para este estudio. Las alícuotas de sangre periférica necesarias para los análisis específicos del estudio se recolectarán además de las muestras de rutina tomadas durante los tratamientos y seguimientos de los pacientes, utilizando el mismo acceso venoso. En concreto, las muestras se tomarán al inicio de la radioterapia, tres semanas después de su inicio y al final, en el contexto de los exámenes y visitas programadas por la práctica clínica habitual.

Durante la primera visita, según la práctica clínica, se recogerá información relacionada con la historia clínica del paciente (historia oncológica, historia patológica remota, historia farmacológica, historia familiar). Se realizará un examen físico general y se planificará la vía de radioterapia. Se evaluará la elegibilidad del paciente para el estudio PROPER y, en caso afirmativo, se obtendrán los consentimientos informados.

Metodología de análisis:

Las características demográficas y clínicas de los pacientes se describirán mediante mediana y rango intercuartil (para variables continuas) y frecuencias absolutas y porcentajes (para variables categóricas).

La evaluación de la capacidad predictiva de las vesículas se realizará mediante análisis de sensibilidad y especificidad de los puntos de corte predefinidos (CD69+ > 349 unidades absolutas; CD86+ > 10 unidades absolutas; CD3+ > 4 unidades absolutas) para verificar que todos tienen un valor predictivo positivo ( VPP) > 80%. También se realizará un análisis ROC utilizando los valores originales de las vesículas para identificar cualquier valor de corte alternativo que pueda discriminar mejor el resultado.

El análisis de la supervivencia libre de enfermedad a los dos años desde el inicio de la terapia se realizará de forma descriptiva mediante curvas de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos. Los pacientes que fallecieron por complicaciones mortales serán censurados en la fecha de su fallecimiento. Dado el pequeño tamaño de la población de estudio, se podrán realizar regresiones de Cox, incluyendo el indicador de si se superó el límite vesicular como factor de riesgo, junto con un máximo de un factor de confusión, siempre que el número de eventos (recurrencias de la enfermedad) sea el adecuado. para el análisis.