Przewidywanie wyników i spersonalizowana radioterapia za pomocą biomarkerów i obrazowania funkcjonalnego

Jest to monocentryczne, eksploracyjne badanie eksperymentalne na tkankach (krwi obwodowej), dlatego zaplanowano włączenie ograniczonej liczby pacjentów. Wyników uzyskanych w badaniu nie należy uważać za rozstrzygające, lecz raczej za generator hipotez badawczych do ewentualnych kolejnych badań na większych populacjach. Charakterystyka jakościowa i ilościowa pęcherzyków oraz zawartość miRNA zostaną przeanalizowane opisowo.

Cel główny zostanie uznany za osiągnięty, jeśli wartości pęcherzyków CD69+ > 349 jednostek bezwzględnych prawidłowo przewidują odpowiedź na radioterapię u co najmniej 80% pacjentów. Następnie badacze mają na celu sprawdzenie, czy pęcherzyki CD86+ > 10 jednostek bezwzględnych i CD3+ > 4 jednostek bezwzględnych prawidłowo przewidują odpowiedź na radioterapię w co najmniej 80% przypadków. Dodatkowo zbadany zostanie związek pomiędzy wartościami trzech wskazanych pęcherzyków (zarówno pierwotnymi, jak i dychotomizowanymi powyżej lub poniżej określonych wartości odcięcia, uzyskanymi ze wstępnych wyników naszej grupy badawczej) i czasem do nawrotu choroby po dwóch latach.

Pacjenci będą leczeni zgodnie z praktyką kliniczną, zgodnie z oceną lekarza i informacjami zawartymi w Karcie Danych Technicznych każdego produktu lub wszelkich terapii skojarzonych stosowanych zgodnie z praktyką kliniczną. Wyniki badań tkankowych przeprowadzonych na potrzeby badania nie będą miały żadnego wpływu na ścieżkę diagnostyczno-terapeutyczną pacjentów.

Badania TC-PET, w ramach normalnego procesu diagnostyczno-terapeutycznego, zostaną przeprowadzone na Oddziale Medycyny Nuklearnej Szpitala Uniwersyteckiego IRCCS w Bolonii. Badania molekularne będą prowadzone w laboratorium Zakładu Immunogenetyki i Biologii Transplantacyjnej (IBT) stowarzyszonego ze Szpitalem Uniwersyteckim IRCCS w Bolonii, Poliklinika S. Orsola. Badanie skierowane jest do pacjentów poddawanych w ciągu jednego roku neoadjuwantowej RT z powodu miejscowo zaawansowanych guzów odbytnicy. Oczekuje się, że badanie rozpocznie się w dniu 01.05.2023 r., a w każdym razie dopiero po uzyskaniu zgody Komisji ds. Etyki i późniejszym wydaniu zezwolenia firmy.

Pacjenci zostaną zapisani podczas pierwszej wizyty w Oddziale Radioterapii Szpitala Uniwersyteckiego IRCCS w Bolonii, przed pobraniem próbek niezbędnych do konkretnych analiz badania. Należy zaznaczyć, że badania nad całkowitą kwantyfikacją DNA i zmianami epigenetycznymi (metylacja i ekspresja miRNA) nie obejmują sekwencjonowania genomu. Cząsteczki DNA zostaną zbadane bez uwzględnienia indywidualnej specyficzności; dlatego kod genetyczny danej osoby pozostaje nieznany po badaniu. Od każdego pacjenta zostanie pobrana próbka 10 ml krwi żylnej za pomocą próżniowego pojemnika z EDTA, a następnie w każdym punkcie doświadczalnym zostanie pobrane osocze. Próbki biologiczne będą opatrzone pseudonimem i oznaczone progresywnym numerem RT/NEO/00N. Wszystkie próbki do czasu wykorzystania będą przechowywane w specjalnie oznakowanych pojemnikach RT w zamykanej zamrażarce znajdującej się na terenie laboratorium IBT. Transport będzie realizowany przy użyciu szczelnego i dedykowanego kontenera o kontrolowanej temperaturze, przez personel zaangażowany w projekt.

Od jednego pacjenta zostaną poddane analizie trzy próbki: I próbka: 1-5 dni przed rozpoczęciem RT, II próbka: pod koniec 3 tygodnia RT, III próbka: ostatniego dnia RT. W związku z tym oczekuje się, że analizie zostanie poddanych ogółem 90 próbek.

Izolacja nanopęcherzyków: próbki osocza zostaną poddane obróbce w celu rozdzielenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez ultrafiltrację w żelu kolumnowym ze sterylizowaną i buforowaną żywicą CL-B4. Nanopęcherzyki zostaną następnie poddane obróbce do analizy fenotypowej przy użyciu zestawu Miltenyi MACSPEX i poddane obróbce do ekstrakcji DNA/RNA przy użyciu zestawu Nucleo Spin Tissue (Macherey Nagel, M-Medical, Mediolan, Włochy). Zabieg zostanie przeprowadzony w laboratorium IBT Szpitala Uniwersyteckiego IRCCS w Bolonii.

Analiza epigenetyczna:

• Analiza mikroRNA Próbki RNA wyekstrahowane z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zostaną przeanalizowane pod kątem zawartości mikroRNA przy użyciu metody Droplet Digital PCR w laboratorium IBT.
• Analiza metylacji Analiza profilu metylacji DNA jądrzastych komórek krwi zostanie przeprowadzona przy użyciu spektrometrii mas wykonanej na platformie Sequenom i protokole EpiTyper (Sequenom) w laboratorium IBT szpitala uniwersyteckiego IRCCS w Bolonii. Wszelkie analizy statystyczne będą wykonywane w jednostce IBT.

Wizyty, oceny oraz leczenie ogólnoustrojowe i lokalne będą przeprowadzane zgodnie z praktyką kliniczną i nie zostaną zmienione na potrzeby tego badania. Porcje krwi obwodowej wymagane do analiz w konkretnym badaniu będą pobierane oprócz rutynowych próbek pobieranych podczas leczenia pacjentów i podczas kontroli, przy użyciu tego samego dostępu żylnego. W szczególności próbki zostaną pobrane na początku radioterapii, trzy tygodnie po jej rozpoczęciu oraz na końcu, w ramach badań i wizyt przewidzianych w zwykłej praktyce klinicznej.

Podczas pierwszej wizyty, zgodnie z praktyką kliniczną, zostaną zebrane informacje związane z historią kliniczną pacjenta (wywiad onkologiczny, odległy wywiad patologiczny, wywiad farmakologiczny, wywiad rodzinny). Zostanie przeprowadzone ogólne badanie przedmiotowe i zaplanowana zostanie ścieżka radioterapii. Zostanie oceniona kwalifikacja pacjenta do badania PROPER i, jeśli będzie pozytywna, uzyskana zostanie świadoma zgoda.

Metodologia analizy:

Charakterystyka demograficzna i kliniczna pacjentów zostanie opisana za pomocą mediany i rozstępu międzykwartylowego (dla zmiennych ciągłych) oraz bezwzględnych częstotliwości i wartości procentowych (dla zmiennych kategorycznych).

Ocena zdolności predykcyjnej pęcherzyków zostanie przeprowadzona poprzez analizę czułości i specyficzności wcześniej zdefiniowanych wartości odcięcia (CD69+ > 349 jednostek bezwzględnych; CD86+ > 10 jednostek bezwzględnych; CD3+ > 4 jednostki bezwzględne) w celu sprawdzenia, czy wszystkie mają dodatnią wartość predykcyjną ( PPV) > 80%. Przeprowadzona zostanie również analiza ROC z wykorzystaniem oryginalnych wartości pęcherzyków w celu zidentyfikowania alternatywnych wartości odcięcia, które mogą lepiej różnicować wynik.

Analiza przeżycia wolnego od choroby po dwóch latach od rozpoczęcia terapii zostanie przeprowadzona opisowo z wykorzystaniem krzywych Kaplana-Meiera i testu log-rank. Pacjenci, którzy zmarli z powodu powikłań śmiertelnych, będą cenzurowani w dacie śmierci. Ze względu na małą liczebność badanej populacji można wykonać regresję Coxa, uwzględniając wskaźnik przekroczenia pęcherzykowego punktu odcięcia jako czynnik ryzyka wraz z maksymalnie jednym czynnikiem zakłócającym, pod warunkiem, że liczba zdarzeń (nawrotów choroby) jest odpowiednia do analizy.