Прогнозирование результатов и персонализированная лучевая терапия с помощью биомаркеров и функциональной визуализации

Это моноцентрическое исследовательское экспериментальное исследование тканей (периферической крови), поэтому запланировано участие ограниченного числа пациентов. Результаты, полученные в результате исследования, не следует рассматривать как окончательные, а скорее как генераторы исследовательских гипотез для потенциальных последующих исследований, которые будут проводиться на более крупных популяциях. Качественные и количественные характеристики везикул и содержание в них микроРНК будут проанализированы описательно.

Основная цель будет считаться достигнутой, если значения CD69+ везикул > 349 абсолютных единиц правильно прогнозируют ответ на лучевую терапию по крайней мере у 80% пациентов. Впоследствии исследователи стремятся проверить, правильно ли везикулы CD86+ > 10 абсолютных единиц и CD3+ > 4 абсолютных единиц правильно предсказывают ответ на лучевую терапию по крайней мере в 80% случаев. Кроме того, будет проверена связь между значениями трех указанных везикул (как исходных, так и дихотомированных, как выше или ниже указанных пороговых значений, полученных на основе предварительных результатов нашей исследовательской группы) и временем до рецидива заболевания через два года.

Пациенты будут получать лечение в соответствии с клинической практикой, в соответствии с решением врача и информацией, представленной в технических данных каждого отдельного продукта, а также любых сопутствующих методов лечения, применяемых в соответствии с клинической практикой. Результаты тканевых тестов, проведенных для исследования, никоим образом не повлияют на диагностический и терапевтический путь пациентов.

Исследования TC-PET, как часть обычного диагностического и терапевтического процесса, будут проводиться в отделении ядерной медицины Университетской больницы IRCCS в Болонье. Молекулярные исследования будут проводиться в лаборатории отделения иммуногенетики и биологии трансплантации (IBT), входящего в состав университетской больницы IRCCS Болоньи, поликлиники С. Орсола. Исследование направлено на пациентов, которым в течение одного года проводится неоадъювантная лучевая терапия по поводу местно-распространенных опухолей прямой кишки. Ожидается, что исследование начнется 05.01.2023 и в любом случае только после одобрения Комитета по этике и последующего выдачи разрешения компании.

Пациенты будут зачислены во время первого визита в отделение лучевой терапии Университетской больницы IRCCS в Болонье до взятия каких-либо образцов, необходимых для конкретного анализа исследования. Следует отметить, что исследования по тотальной количественной оценке ДНК и эпигенетических изменений (метилирования и экспрессии микроРНК) не связаны с секвенированием генома. Молекулы ДНК будут исследоваться без учета индивидуальной специфичности; следовательно, генетический код человека остается неизвестным после обследования. У каждого пациента с помощью вакутейнера с ЭДТА будет взята проба венозной крови объемом 10 мл, а для каждой экспериментальной точки будет собрана плазма. Биологическим образцам будет присвоен псевдоним и присвоен прогрессивный номер RT/NEO/00N. Все образцы будут храниться в специально маркированных контейнерах RT в запираемой морозильной камере, расположенной в лаборатории ИБТ, до их использования. Транспортировка будет осуществляться персоналом, участвующим в проекте, в специальном герметичном контейнере с контролируемой температурой.

Для каждого пациента будут проанализированы три образца: 1-й образец: за 1–5 дней до начала ЛТ, 2-й образец: в конце 3-й недели ЛТ, 3-й образец: в последний день ЛТ. Таким образом, всего ожидается анализ 90 проб.

Выделение нановезикул: образцы плазмы будут обработаны для отделения внеклеточных везикул посредством колоночной гель-ультрафильтрации со стерилизованной и забуференной смолой CL-B4. Затем нановезикулы будут обработаны для фенотипического анализа с использованием набора MilteNY MACSPEX и обработаны для экстракции ДНК/РНК с использованием набора Nucleo Spin Tissue (Macherey Nagel, M-Medical, Милан, Италия). Процедура будет проводиться в лаборатории IBT Университетской больницы IRCCS Болоньи.

Эпигенетический анализ:

• Анализ микроРНК. Образцы РНК, извлеченные из внеклеточных везикул, будут проанализированы на содержание микроРНК с помощью капельной цифровой ПЦР в лаборатории IBT.
• Анализ метилирования. Анализ профиля метилирования ДНК ядросодержащих клеток крови будет проводиться с использованием масс-спектрометрии, выполненной на платформе Sequenom и протоколе EpiTyper (Sequenom) в лаборатории IBT Университетской больницы IRCCS в Болонье. Все статистические анализы будут выполняться в подразделении IBT.

Визиты, оценки, а также системное и местное лечение будут проводиться в соответствии с клинической практикой и не будут изменены для данного исследования. Аликвоты периферической крови, необходимые для конкретных анализов исследования, будут собираться в дополнение к обычным образцам, взятым во время лечения и последующего наблюдения пациентов, используя тот же венозный доступ. В частности, образцы будут взяты в начале лучевой терапии, через три недели после начала и в конце в рамках обследований и посещений, запланированных в обычной клинической практике.

Во время первого визита, согласно клинической практике, будет собрана информация, относящаяся к клиническому анамнезу пациента (онкологический анамнез, отдаленный патологический анамнез, фармакологический анамнез, семейный анамнез). Будет проведен общий медицинский осмотр и запланирован курс лучевой терапии. Будет оценено право пациента на участие в исследовании PROPER, и в случае положительного ответа будет получено информированное согласие.

Методология анализа:

Демографические и клинические характеристики пациентов будут описаны с использованием медианы и интерквартильного диапазона (для непрерывных переменных), а также абсолютных частот и процентов (для категориальных переменных).

Оценка прогностической способности везикул будет проводиться посредством анализа чувствительности и специфичности заранее определенных пороговых значений (CD69+ > 349 абсолютных единиц; CD86+ > 10 абсолютных единиц; CD3+ > 4 абсолютных единиц) для проверки того, что все они имеют положительную прогностическую ценность ( ППВ) > 80%. ROC-анализ с использованием исходных значений везикул также будет проводиться для выявления любых альтернативных пороговых значений, которые могут лучше различать результат.

Анализ безрецидивной выживаемости через два года от начала терапии будет проводиться описательно с использованием кривых Каплана-Мейера и лог-рангового теста. Пациенты, умершие из-за фатальных осложнений, будут подвергаться цензуре в день смерти. Учитывая небольшой размер исследуемой популяции, можно выполнить регрессию Кокса, включая показатель превышения везикулярного порога в качестве фактора риска, а также максимум один искажающий фактор, при условии, что количество событий (рецидивов заболевания) является адекватным. для анализа.