Tulosten PR-ennustus ja henkilökohtainen sädehoito biomarkkerien ja funktionaalisen kuvantamisen avulla

Kyseessä on yksikeskinen, kokeellinen tutkimus kudoksilla (perifeerinen veri), minkä vuoksi on suunniteltu rajoitetun määrän potilaita. Tutkimuksesta saatuja tuloksia ei pidä pitää ratkaisevina, vaan pikemminkin tutkimushypoteesien luojina mahdollisia myöhempiä tutkimuksia varten, jotka tehdään suuremmilla populaatioilla. Vesikkeleiden kvalitatiiviset ja kvantitatiiviset ominaisuudet ja niiden miRNA-pitoisuus analysoidaan kuvailevasti.

Ensisijainen tavoite katsotaan saavutetuksi, jos CD69+ -vesikkeleiden arvot > 349 absoluuttista yksikköä ennustavat oikein sädehoitovasteen vähintään 80 %:lla potilaista. Tämän jälkeen tutkijat pyrkivät varmistamaan, ennustavatko CD86+-vesikkelit > 10 absoluuttista yksikköä ja CD3+ > 4 absoluuttista yksikköä oikein sädehoitovasteen vähintään 80 %:ssa tapauksista. Lisäksi testataan kolmen ilmoitetun vesikkelin arvojen (sekä alkuperäisten että dikotomisoitujen, kuten määritettyjen raja-arvojen ylä- tai alapuolella, tutkimusryhmämme alustavista tuloksista johdettu) ja taudin uusiutumiseen kuluvan ajan välinen yhteys kahden vuoden kohdalla.

Potilaita hoidetaan kliinisen käytännön mukaisesti lääkärin harkinnan ja kunkin yksittäisen tuotteen teknisessä tuoteselosteessa annettujen tietojen mukaisesti mahdollisista samanaikaisista hoidoista kliinisen käytännön mukaisesti. Tutkimusta varten tehtyjen kudostutkimusten tulokset eivät vaikuta millään tavalla potilaiden diagnost-terapeuttiseen polkuun.

TC-PET-tutkimukset osana normaalia diagnostis-terapeuttista prosessia suoritetaan Bolognan IRCCS-yliopistosairaalan isotooppilääketieteen yksikössä. Molekyylitutkimukset suoritetaan Bolognan IRCCS-yliopistosairaalaan kuuluvan Immunogenetics and Transplant Biology Unit -yksikön (IBT) laboratoriossa, S. Orsolan poliklinikalla. Tutkimus on suunnattu potilaille, joille tehdään vuoden sisällä neoadjuvantti-RT paikallisesti edenneiden peräsuolen kasvainten vuoksi. Selvityksen odotetaan alkavan 1.5.2023 ja joka tapauksessa vasta eettisen toimikunnan hyväksynnän ja sen jälkeen yhtiön valtuutuksen jälkeen.

Potilaat rekisteröidään ensimmäisellä käynnillä Bolognan IRCCS-yliopistosairaalan sädehoitoyksikössä, ennen kuin näytteenotto on tarpeen erityisiä tutkimusanalyysejä varten. On huomattava, että DNA:n kokonaiskvantifiointia ja epigeneettisiä muutoksia (metylaatio ja miRNA:n ilmentyminen) koskevat tutkimukset eivät sisällä genomin sekvensointia. DNA-molekyylejä tutkitaan ottamatta huomioon yksilöllistä spesifisyyttä; siksi yksilön geneettinen koodi jää tuntemattomaksi tutkimuksen jälkeen. Jokaiselta potilaalta otetaan 10 ml:n näyte laskimoverta käyttämällä EDTA:ta sisältävää vacutainer-laitetta, ja plasma kerätään jokaisesta koepisteestä. Biologiset näytteet pseudonyymitetään ja merkitään progressiivisella numerolla RT/NEO/00N. Kaikki näytteet säilytetään erikoismerkityissä RT-säiliöissä IBT-laboratoriossa sijaitsevassa lukitussa pakastimessa käyttöön asti. Kuljetukset suoritetaan hankkeeseen osallistuvan henkilöstön toimesta suljetussa ja lämpötilasäädellyssä erityissäiliössä.

Potilasta kohden analysoidaan kolme näytettä: 1. näyte: 1-5 päivää ennen RT-hoidon alkua, 2. näyte: 3. RT-viikon lopussa, 3. näyte: RT-hoidon viimeisenä päivänä. Tästä syystä odotetaan analysoitavan yhteensä 90 näytettä.

Nanovesikkelien eristäminen: Plasmanäytteet käsitellään ekstrasellulaaristen vesikkelien erottamiseksi kolonnigeeliultrasuodatuksella steriloidulla ja puskuroidulla CL-B4-hartsilla. Nanovesikkelit käsitellään sitten fenotyyppianalyysiä varten Miltenyi MACSPEX -pakkauksella ja DNA/RNA-uutto käyttämällä Nucleo Spin Tissue -pakkausta (Macherey Nagel, M-Medical, Milano, Italia). Toimenpide suoritetaan Bolognan IRCCS-yliopistosairaalan IBT-laboratoriossa.

Epigeneettinen analyysi:

• MikroRNA-analyysi Ekstrasellulaarisista vesikkeleistä uutetuista RNA-näytteistä analysoidaan mikroRNA-pitoisuus käyttämällä Droplet Digital PCR:ää IBT-laboratoriossa.
• Metylaatioanalyysi Tumallisten verisolujen DNA-metylaatioprofiilianalyysi suoritetaan käyttäen massaspektrometriaa, joka suoritetaan Sequenom-alustalla ja EpiTyper-protokollalla (Sequenom) Bolognan IRCCS-yliopistosairaalan IBT-laboratoriossa. Kaikki tilastolliset analyysit tehdään IBT-yksikössä.

Käynnit, arvioinnit sekä systeemiset ja paikalliset hoidot suoritetaan kliinisen käytännön mukaisesti, eikä niitä muuteta tässä tutkimuksessa. Erikoistutkimusanalyyseihin tarvittavat perifeerisen veren alikvootit kerätään rutiininäytteiden lisäksi, jotka otetaan potilashoidon ja seurannan aikana, käyttäen samaa laskimoa. Erityisesti näytteet otetaan sädehoidon alussa, kolmen viikon kuluttua aloittamisesta ja lopussa, normaalin kliinisen käytännön mukaisten tutkimusten ja käyntien yhteydessä.

Ensimmäisellä käynnillä kerätään kliinisen käytännön mukaisesti potilaan kliiniseen historiaan liittyvät tiedot (onkologinen historia, etäpatologinen historia, lääkehistoria, sukuhistoria). Tehdään yleinen fyysinen tutkimus ja suunnitellaan sädehoitopolku. Potilaan kelpoisuus PROPER-tutkimukseen arvioidaan, ja jos se on myönteinen, hankitaan tietoinen suostumus.

Analyysimenetelmät:

Potilaiden demografiset ja kliiniset ominaisuudet kuvataan käyttämällä mediaani- ja interkvartiilialuetta (jatkuvien muuttujien osalta) sekä absoluuttisia esiintymistiheyksiä ja prosenttiosuuksia (kategorisille muuttujille).

Vesikkeleiden ennustuskyvyn arviointi suoritetaan ennalta määritettyjen raja-arvojen (CD69+ > 349 absoluuttista yksikköä; CD86+ > 10 absoluuttista yksikköä; CD3+ > 4 absoluuttista yksikköä) herkkyys- ja spesifisyysanalyysillä sen varmistamiseksi, että kaikilla on positiivinen ennustearvo ( PPV) > 80 %. ROC-analyysi, jossa käytetään vesikkelien alkuperäisiä arvoja, suoritetaan myös mahdollisten vaihtoehtoisten raja-arvojen tunnistamiseksi, jotka voivat paremmin erottaa tuloksen.

Kahden vuoden taudista eloonjäämisen analyysi hoidon aloittamisesta tehdään kuvailevasti Kaplan-Meier-käyrien ja log-rank-testin avulla. Potilaat, jotka kuolivat kuolemaan johtaneisiin komplikaatioihin, sensuroidaan kuolinpäivänä. Tutkimuspopulaation pienen koon vuoksi voidaan suorittaa Cox-regressioita, mukaan lukien indikaattori siitä, onko vesikulaarinen raja ylitetty riskitekijänä, sekä enintään yksi hämmennystekijä, mikäli tapahtumien (taudin uusiutumisten) määrä on riittävä. analyysiä varten.