Previsione dei risultati e radioterapia personalizzata mediante biomarcatori e imaging funzionale

Si tratta di uno studio sperimentale esplorativo monocentrico sui tessuti (sangue periferico), motivo per cui è stato previsto l'arruolamento di un numero limitato di pazienti. I risultati ottenuti dallo studio non devono essere considerati conclusivi ma piuttosto generatori di ipotesi di ricerca per eventuali studi successivi da condurre su popolazioni più ampie. Le caratteristiche qualitative e quantitative delle vescicole e il loro contenuto di miRNA verranno analizzati in modo descrittivo.

L'obiettivo primario sarà considerato raggiunto se valori di vescicole CD69+ > 349 unità assolute predicono correttamente la risposta alla radioterapia in almeno l'80% dei pazienti. Successivamente, i ricercatori si proponeranno di verificare se le vescicole CD86+ > 10 unità assolute e CD3+ > 4 unità assolute predicono correttamente la risposta alla radioterapia in almeno l'80% dei casi. Inoltre, verrà testata l'associazione tra i valori delle tre vescicole indicate (sia originali che dicotomizzate come sopra o sotto i cut-off specificati, derivati ​​​​da risultati preliminari del nostro gruppo di ricerca) e il tempo alla recidiva della malattia a due anni.

I pazienti verranno trattati secondo la pratica clinica in accordo con il giudizio del medico e le informazioni fornite nella Scheda Tecnica di ogni singolo prodotto delle eventuali terapie concomitanti somministrate come da pratica clinica. Il percorso diagnostico-terapeutico dei pazienti non sarà influenzato in alcun modo dai risultati dei test tissutali condotti per lo studio.

Le indagini TC-PET, nell'ambito del normale iter diagnostico-terapeutico, verranno eseguite presso l'Unità Operativa di Medicina Nucleare dell'IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria di Bologna. Le indagini molecolari verranno effettuate presso il laboratorio dell'Unità di Immunogenetica e Biologia dei Trapianti (IBT) convenzionato con l'IRCCS Policlinico S. Orsola. Lo studio è rivolto a pazienti sottoposti a RT neoadiuvante per tumori del retto localmente avanzati entro un anno. L'inizio dello studio è previsto il giorno 01/05/2023, e comunque solo dopo l'approvazione del Comitato Etico e il successivo rilascio del nulla osta da parte della società.

I pazienti verranno arruolati durante la prima visita presso l'Unità di Radioterapia dell'IRCCS Ospedale Universitario di Bologna, prima di qualsiasi prelievo necessario per le analisi specifiche dello studio. Va notato che le indagini sulla quantificazione totale del DNA e sui cambiamenti epigenetici (metilazione ed espressione di miRNA) non comportano il sequenziamento del genoma. Le molecole di DNA verranno esaminate senza considerare la specificità individuale; pertanto, il codice genetico dell'individuo rimane sconosciuto dopo l'esame. Un campione di 10 ml di sangue venoso verrà raccolto utilizzando un vacutainer con EDTA da ciascun paziente e il plasma verrà raccolto per ciascun punto sperimentale. I campioni biologici saranno pseudonimizzati ed etichettati con il numero progressivo RT/NEO/00N. Tutti i campioni verranno conservati in contenitori RT appositamente contrassegnati in un congelatore chiuso a chiave situato nel laboratorio IBT fino al loro utilizzo. Il trasporto sarà effettuato mediante apposito contenitore sigillato e a temperatura controllata dal personale coinvolto nel progetto.

Verranno analizzati tre campioni per paziente: 1° campione: 1-5 giorni prima dell'inizio della RT, 2° campione: alla fine della 3a settimana di RT, 3° campione: l'ultimo giorno della RT. Si prevede pertanto di analizzare un totale di 90 campioni.

Isolamento di Nanovesicole: i campioni di plasma verranno processati per la separazione delle vescicole extracellulari mediante ultrafiltrazione su colonna di gel con resina CL-B4 sterilizzata e tamponata. Le nanovescicole verranno quindi processate per l'analisi fenotipica utilizzando il kit Miltenyi MACSPEX e processate per l'estrazione del DNA/RNA utilizzando il kit Nucleo Spin Tissue (Macherey Nagel, M-Medical, Milano, Italia). La procedura sarà effettuata presso il laboratorio IBT dell'IRCCS Ospedale Universitario di Bologna.

Analisi epigenetica:

• Analisi dei microRNA I campioni di RNA estratti dalle vescicole extracellulari verranno analizzati per il contenuto di microRNA utilizzando Droplet Digital PCR presso il laboratorio IBT.
• Analisi di metilazione L'analisi del profilo di metilazione del DNA delle cellule ematiche nucleate sarà condotta utilizzando la spettrometria di massa eseguita sulla piattaforma Sequenom e il protocollo EpiTyper (Sequenom) presso il laboratorio IBT dell'IRCCS Ospedale Universitario di Bologna. Tutte le analisi statistiche saranno eseguite presso l'unità IBT.

Visite, valutazioni e trattamenti sistemici e locali saranno effettuati secondo la pratica clinica e non verranno modificati per questo studio. Le aliquote di sangue periferico necessarie per le analisi specifiche dello studio verranno raccolte in aggiunta ai campioni di routine prelevati durante i trattamenti e i follow-up dei pazienti, utilizzando lo stesso accesso venoso. Nello specifico, i prelievi verranno effettuati all'inizio della radioterapia, tre settimane dopo l'inizio, e al termine, nell'ambito degli esami e delle visite previste dalla normale pratica clinica.

Nel corso della prima visita, secondo la pratica clinica, verranno raccolte le informazioni relative alla storia clinica del paziente (storia oncologica, storia patologica remota, storia farmacologica, storia familiare). Verrà effettuato un esame obiettivo generale e verrà pianificato il percorso radioterapico. Verrà valutata l'idoneità del paziente per lo studio PROPER e, in caso affermativo, verranno ottenuti i consensi informati.

Metodologia di analisi:

Le caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti saranno descritte utilizzando la mediana e l'intervallo interquartile (per variabili continue) e frequenze e percentuali assolute (per variabili categoriali).

La valutazione della capacità predittiva delle vescicole sarà effettuata attraverso l'analisi di sensibilità e specificità dei cutoff predefiniti (CD69+ > 349 unità assolute; CD86+ > 10 unità assolute; CD3+ > 4 unità assolute) per verificare che tutte abbiano un valore predittivo positivo ( VPP) > 80%. Verrà inoltre condotta l'analisi ROC utilizzando i valori originali delle vescicole per identificare eventuali valori limite alternativi che possano meglio discriminare riguardo al risultato.

L'analisi della sopravvivenza libera da malattia a due anni dall'inizio della terapia sarà condotta in modo descrittivo utilizzando le curve di Kaplan-Meier e il log-rank test. I pazienti deceduti a causa di complicazioni mortali verranno censurati alla data della morte. Considerate le dimensioni ridotte della popolazione in studio, è possibile eseguire regressioni di Cox, includendo come fattore di rischio l'indicatore se il cut-off vescicolare è stato superato, insieme a un massimo di un confondente, a condizione che il numero di eventi (recidive della malattia) sia adeguato per l'analisi.