Previsão de resultados e radioterapia personalizada por biomarcadores e imagens funcionais

Este é um estudo experimental exploratório monocêntrico em tecidos (sangue periférico), razão pela qual foi planejada a inscrição de um número limitado de pacientes. Os resultados obtidos no estudo não devem ser considerados conclusivos, mas sim como geradores de hipóteses de pesquisa para potenciais estudos subsequentes a serem realizados em populações maiores. As características qualitativas e quantitativas das vesículas e seu conteúdo de miRNA serão analisadas descritivamente.

O objetivo primário será considerado alcançado se os valores das vesículas CD69+ > 349 unidades absolutas predizerem corretamente a resposta à radioterapia em pelo menos 80% dos pacientes. Posteriormente, os investigadores pretendem verificar se as vesículas CD86+ > 10 unidades absolutas e CD3+ > 4 unidades absolutas predizem corretamente a resposta à radioterapia em pelo menos 80% dos casos. Além disso, será testada a associação entre os valores das três vesículas indicadas (originais e dicotomizadas como acima ou abaixo dos pontos de corte especificados, derivados de resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa) e o tempo para recorrência da doença em dois anos.

Os pacientes serão tratados de acordo com a prática clínica, de acordo com o julgamento do médico e as informações fornecidas na Ficha Técnica de cada produto individual de quaisquer terapias concomitantes administradas de acordo com a prática clínica. A via diagnóstico-terapêutica dos pacientes não será influenciada de forma alguma pelos resultados dos exames teciduais realizados para o estudo.

As investigações TC-PET, como parte do processo diagnóstico-terapêutico normal, serão realizadas na Unidade de Medicina Nuclear do Hospital Universitário IRCCS de Bolonha. As investigações moleculares serão realizadas no laboratório da Unidade de Imunogenética e Biologia de Transplantes (IBT) afiliada ao Hospital Universitário IRCCS de Bolonha, Policlínica S. Orsola. O estudo é direcionado a pacientes submetidos à RT neoadjuvante para tumores retais localmente avançados no prazo de um ano. O início do estudo está previsto para 05/01/2023, e em qualquer caso, somente após aprovação do Comitê de Ética e posterior liberação da autorização da empresa.

Os pacientes serão inscritos durante a primeira visita à Unidade de Radioterapia do Hospital Universitário IRCCS de Bolonha, antes de qualquer amostragem necessária para as análises específicas do estudo. Ressalta-se que as investigações sobre a quantificação total do DNA e alterações epigenéticas (metilação e expressão de miRNA) não envolvem sequenciamento do genoma. As moléculas de DNA serão examinadas sem considerar a especificidade individual; portanto, o código genético do indivíduo permanece desconhecido após o exame. Uma amostra de 10 ml de sangue venoso será coletada em vacutainer com EDTA de cada paciente e será coletado plasma para cada ponto experimental. As amostras biológicas serão pseudonimizadas e rotuladas com o número progressivo RT/NEO/00N. Todas as amostras serão armazenadas em recipientes RT especialmente marcados em um freezer trancado localizado no laboratório do IBT até seu uso. O transporte será realizado em contêiner dedicado, lacrado e com temperatura controlada pelo pessoal envolvido no projeto.

Serão analisadas três amostras por paciente: 1ª amostra: 1-5 dias antes do início da RT, 2ª amostra: ao final da 3ª semana de RT, 3ª amostra: no último dia de RT. Portanto, espera-se que sejam analisadas um total de 90 amostras.

Isolamento de Nanovesículas: amostras de plasma serão processadas para separação de vesículas extracelulares através de ultrafiltração em coluna de gel com resina CL-B4 esterilizada e tamponada. As nanovesículas serão então processadas para análise fenotípica utilizando o kit Miltenyi MACSPEX e processadas para extração de DNA/RNA utilizando o kit Nucleo Spin Tissue (Macherey Nagel, M-Medical, Milão, Itália). O procedimento será realizado no laboratório IBT do Hospital Universitário IRCCS de Bolonha.

Análise Epigenética:

• Análise de MicroRNA As amostras de RNA extraídas das vesículas extracelulares serão analisadas quanto ao conteúdo de microRNA usando Droplet Digital PCR no laboratório IBT.
• Análise de Metilação A análise do perfil de metilação do DNA de células sanguíneas nucleadas será realizada por meio de espectrometria de massa realizada na plataforma Sequenom e no protocolo EpiTyper (Sequenom) no laboratório IBT do Hospital Universitário IRCCS de Bolonha. Todas as análises estatísticas serão realizadas na unidade IBT.

Visitas, avaliações e tratamentos sistêmicos e locais serão realizados de acordo com a prática clínica e não serão alterados para este estudo. As alíquotas de sangue periférico necessárias para as análises específicas do estudo serão coletadas além das amostras de rotina colhidas durante o tratamento e acompanhamento dos pacientes, utilizando o mesmo acesso venoso. Especificamente, as amostras serão colhidas no início da radioterapia, três semanas após o início, e no final, no contexto de exames e consultas agendadas pela prática clínica normal.

Durante a primeira consulta, de acordo com a prática clínica, serão coletadas informações relacionadas à história clínica do paciente (história oncológica, história patológica remota, história farmacológica, história familiar). Um exame físico geral será realizado e o caminho da radioterapia será planejado. A elegibilidade do paciente para o estudo PROPER será avaliada e, se afirmativa, serão obtidos consentimentos informados.

Metodologia de Análise:

As características demográficas e clínicas dos pacientes serão descritas por meio de mediana e intervalo interquartil (para variáveis ​​contínuas) e frequências absolutas e percentuais (para variáveis ​​categóricas).

A avaliação da capacidade preditiva das vesículas será realizada por meio de análise de sensibilidade e especificidade dos pontos de corte pré-definidos (CD69+ > 349 unidades absolutas; CD86+ > 10 unidades absolutas; CD3+ > 4 unidades absolutas) para verificar se todos possuem valor preditivo positivo ( VPP) > 80%. A análise ROC usando os valores originais das vesículas também será realizada para identificar quaisquer valores de corte alternativos que possam discriminar melhor em relação ao resultado.

A análise da sobrevida livre de doença aos dois anos do início da terapia será realizada de forma descritiva usando curvas de Kaplan-Meier e o teste log-rank. Pacientes que faleceram devido a complicações fatais serão censurados na data do óbito. Dado o pequeno tamanho da população estudada, podem ser realizadas regressões de Cox, incluindo o indicador de superação do ponto de corte vesicular como fator de risco, juntamente com no máximo um confundidor, desde que o número de eventos (recidivas da doença) seja adequado para a análise.