Vorhersage von Ergebnissen und personalisierter Strahlentherapie durch Biomarker und funktionelle Bildgebung

Hierbei handelt es sich um eine monozentrische, explorative experimentelle Studie an Geweben (peripheres Blut), weshalb die Aufnahme einer begrenzten Anzahl von Patienten geplant ist. Die aus der Studie gewonnenen Ergebnisse sollten nicht als schlüssig betrachtet werden, sondern vielmehr als Grundlage für Forschungshypothesen für mögliche Folgestudien, die an größeren Populationen durchgeführt werden sollen. Die qualitativen und quantitativen Eigenschaften der Vesikel und ihr miRNA-Gehalt werden deskriptiv analysiert.

Das primäre Ziel gilt als erreicht, wenn Werte der CD69+-Vesikel > 349 absolute Einheiten das Ansprechen auf die Strahlentherapie bei mindestens 80 % der Patienten korrekt vorhersagen. Anschließend wollen die Forscher überprüfen, ob CD86+-Vesikel > 10 absolute Einheiten und CD3+ > 4 absolute Einheiten das Ansprechen auf die Strahlentherapie in mindestens 80 % der Fälle korrekt vorhersagen. Darüber hinaus wird der Zusammenhang zwischen den Werten der drei angegebenen Vesikel (sowohl Original- als auch dichotomisierte Vesikel oberhalb oder unterhalb der angegebenen Grenzwerte, abgeleitet aus vorläufigen Ergebnissen unserer Forschungsgruppe) und der Zeit bis zum Wiederauftreten der Krankheit nach zwei Jahren getestet.

Die Behandlung der Patienten erfolgt entsprechend der klinischen Praxis, im Einklang mit dem Urteil des Arztes und den Informationen im technischen Datenblatt jedes einzelnen Produkts oder aller begleitenden Therapien, die gemäß der klinischen Praxis verabreicht werden. Der diagnostisch-therapeutische Weg der Patienten wird durch die Ergebnisse der im Rahmen der Studie durchgeführten Gewebetests in keiner Weise beeinflusst.

Die TC-PET-Untersuchungen werden als Teil des normalen diagnostisch-therapeutischen Prozesses in der Nuklearmedizinischen Abteilung des IRCCS-Universitätsklinikums Bologna durchgeführt. Molekulare Untersuchungen werden im Labor der Abteilung für Immungenetik und Transplantationsbiologie (IBT) durchgeführt, die dem IRCCS-Universitätskrankenhaus von Bologna, Poliklinik S. Orsola, angegliedert ist. Die Studie richtet sich an Patienten, die sich innerhalb eines Jahres einer neoadjuvanten RT wegen lokal fortgeschrittener Rektumtumoren unterziehen. Der Beginn der Studie ist voraussichtlich am 01.05.2023 und in jedem Fall erst nach Genehmigung durch die Ethikkommission und der anschließenden Freigabe der Unternehmensgenehmigung.

Die Patienten werden beim ersten Besuch in der Strahlentherapie-Abteilung des IRCCS-Universitätskrankenhauses von Bologna aufgenommen, bevor Proben entnommen werden, die für die spezifischen Studienanalysen erforderlich sind. Es ist zu beachten, dass Untersuchungen zur Gesamtquantifizierung von DNA und epigenetischen Veränderungen (Methylierung und miRNA-Expression) keine Genomsequenzierung beinhalten. Die DNA-Moleküle werden ohne Berücksichtigung individueller Spezifität untersucht; Daher bleibt der genetische Code des Individuums nach der Untersuchung unbekannt. Eine Probe von 10 ml venösem Blut wird mit einem Vacutainer mit EDTA von jedem Patienten entnommen und für jeden Versuchspunkt wird Plasma entnommen. Biologische Proben werden pseudonymisiert und mit der fortlaufenden Nummer RT/NEO/00N gekennzeichnet. Alle Proben werden bis zu ihrer Verwendung in speziell gekennzeichneten RT-Behältern in einem verschlossenen Gefrierschrank im IBT-Labor aufbewahrt. Der Transport erfolgt in einem versiegelten und temperierten Spezialcontainer durch das am Projekt beteiligte Personal.

Pro Patient werden drei Proben analysiert: 1. Probe: 1–5 Tage vor Beginn der RT, 2. Probe: am Ende der 3. Woche der RT, 3. Probe: am letzten Tag der RT. Daher wird erwartet, dass insgesamt 90 Proben analysiert werden.

Isolierung von Nanovesikeln: Plasmaproben werden zur Trennung extrazellulärer Vesikel durch Säulengel-Ultrafiltration mit sterilisiertem und gepuffertem CL-B4-Harz verarbeitet. Die Nanovesikel werden dann für die phänotypische Analyse mit dem Miltenyi MACSPEX-Kit und für die DNA/RNA-Extraktion mit dem Nucleo Spin Tissue-Kit (Macherey Nagel, M-Medical, Mailand, Italien) verarbeitet. Das Verfahren wird im IBT-Labor des IRCCS-Universitätsklinikums Bologna durchgeführt.

Epigenetische Analyse:

• MicroRNA-Analyse Die aus den extrazellulären Vesikeln extrahierten RNA-Proben werden im IBT-Labor mithilfe der Droplet Digital PCR auf ihren microRNA-Gehalt analysiert.
• Methylierungsanalyse Die DNA-Methylierungsprofilanalyse von kernhaltigen Blutzellen wird mittels Massenspektrometrie durchgeführt, die auf der Sequenom-Plattform und dem EpiTyper-Protokoll (Sequenom) im IBT-Labor des IRCCS-Universitätsklinikums von Bologna durchgeführt wird. Alle statistischen Analysen werden in der IBT-Einheit durchgeführt.

Besuche, Beurteilungen sowie systemische und lokale Behandlungen werden gemäß der klinischen Praxis durchgeführt und für diese Studie nicht geändert. Die für die spezifischen Studienanalysen erforderlichen Aliquots des peripheren Blutes werden zusätzlich zu den Routineproben entnommen, die während der Patientenbehandlungen und Nachsorgeuntersuchungen über denselben venösen Zugang entnommen werden. Konkret werden die Proben zu Beginn der Strahlentherapie, drei Wochen nach Beginn und am Ende im Rahmen der im Rahmen der normalen klinischen Praxis vorgesehenen Untersuchungen und Besuche entnommen.

Beim ersten Besuch werden gemäß der klinischen Praxis Informationen zur klinischen Vorgeschichte des Patienten (onkologische Vorgeschichte, entfernte pathologische Vorgeschichte, pharmakologische Vorgeschichte, Familiengeschichte) gesammelt. Es wird eine allgemeine körperliche Untersuchung durchgeführt und der Weg der Strahlentherapie geplant. Die Eignung des Patienten für die PROPER-Studie wird beurteilt, und wenn ja, werden informierte Einwilligungen eingeholt.

Analysemethodik:

Die demografischen und klinischen Merkmale der Patienten werden anhand des Median- und Interquartilbereichs (für kontinuierliche Variablen) sowie absoluter Häufigkeiten und Prozentsätze (für kategoriale Variablen) beschrieben.

Die Bewertung der Vorhersagefähigkeit der Vesikel erfolgt durch Sensitivitäts- und Spezifitätsanalyse der vordefinierten Grenzwerte (CD69+ > 349 absolute Einheiten; CD86+ > 10 absolute Einheiten; CD3+ > 4 absolute Einheiten), um zu überprüfen, ob alle einen positiven Vorhersagewert haben ( PPV) > 80 %. Es wird auch eine ROC-Analyse unter Verwendung der ursprünglichen Werte der Vesikel durchgeführt, um alternative Cutoff-Werte zu identifizieren, die eine bessere Unterscheidung hinsichtlich des Ergebnisses ermöglichen könnten.

Die Analyse des krankheitsfreien Überlebens zwei Jahre nach Therapiebeginn wird deskriptiv anhand von Kaplan-Meier-Kurven und dem Log-Rank-Test durchgeführt. Patienten, die aufgrund tödlicher Komplikationen gestorben sind, werden zum Zeitpunkt ihres Todes zensiert. Aufgrund der geringen Größe der Studienpopulation können Cox-Regressionen durchgeführt werden, einschließlich des Indikators, ob der vesikuläre Cutoff als Risikofaktor überschritten wurde, zusammen mit maximal einem Confounder, sofern die Anzahl der Ereignisse (Krankheitsrezidive) ausreichend ist für die Analyse.