Effektiviteten af ​​et Multiplex BangasureTM RT-PCR-kit til påvisning af COVID-19 (COVID-19)

Introduktion:

Corona-virus COVID-19-pandemien er vor tids afgørende globale sundhedskrise og den største udfordring, der har stået over for siden Anden Verdenskrig. Pandemien er meget mere end en sundhedskrise; det er også en hidtil uset socioøkonomisk krise. Siden dens identifikation i regionen Wuhan, Kina, har virussen ikke kun spredt sig over 213 lande/territorier med 209 millioner tilfælde og 4,39 millioner globalt, men kan også sætte 400 millioner mennesker ud af deres job, som Den Internationale Arbejdsorganisation anslår.

For at begrænse spredningen af ​​sygdomme er der blevet lanceret tværfaglige strategier i forskellige regioner i verden, herunder implementering af social distancering, opretholdelse af personlig hygiejne, kontaktopsporing og implementering af karantæne, rejserestriktioner og nedlukninger. En bredt accepteret metode er testning for SARS-CoV-2, typisk ved brug af nasopharyngeale podningsprøver. Patienter, der er testet positive, kræver passende klinisk behandling ved enten effektiv isolation eller karantæne i hjemmet for milde symptomer eller inden for sundhedsfaciliteter for moderate til svære symptomer. Derudover giver bredskala test mere informative epidemiologiske data til udarbejdelse af politikker for sygdomsovervågning og kontrol. Mange tilgange er blevet foreslået til at detektere SARS-CoV-2-virus i nasopharyngeale væsker såsom multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12 og CRISPR-Cas3, lateral flow immunoassay, papirbaserede bimolekylære sensorer, SHERLOCK-test i én pot, DNA-aptamer , loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) osv. Blandt disse metoder er nukleinsyreamplifikationsbaserede tests de mest almindelige til diagnosticering af SARS-CoV-2.

Derudover foreslår US CDC en protokol til påvisning af SARS-CoV-2, baseret på amplifikation af to regioner af nukleocapsid-genet, nemlig N1 og N2, og et humant internt kontrolgen RNase P (RP). Ud over disse strategier er bestræbelserne på at udvikle SARS-CoV-2-detektionsmetoder med høj effektivitet og nøjagtighed, med mindre reaktionstid og indsats, stadig i gang.

Men på trods af, at de anses for at være guldstandarden for SARS CoV-2-detektion, er test haltet bagud i mange lande på grund af forskellige faktorer, hvoraf de vigtigste er forsyningskædeproblemer med mangel på reagenser og passende testsæt. Derfor forbliver mange patienter (både symptomatiske og asymptomatiske) utestede og bidrager derfor potentielt til spredning af virussen i samfundet.

Hvis Bangladesh kan producere sine egne RT-PCR-kits, som ikke er ringere i kvalitet med hensyn til sensitivitet, specificitet osv., ville det afbøde manglen på RT-PCR-kit, da efterforskerne er totalt afhængige af importerede testkits og også spare udenlandsk valuta. Desuden er RT-PCR-testsæt meget temperaturfølsomme og skal opretholde kølekæden for dens kvalitet, hvilket kan afbødes ved at udvikle lokale RT PCR-kit. Derudover er mange varianter af SARS-CoV-2 blevet udviklet på grund af mutation, som har vist mere virulens og høj transmissionshastighed. Så udvikling af nyt RT PCR-kit, som kan detektere nyere stamme, kan være yderst nyttigt.

Så her er efterforskerens mål at udvikle de tre gen-detekterbare robuste RT-PCR-kit, der vil være landet først og give pålidelige resultater af forskellige slags varianter af SARS-CoV-2-virus for at reducere dets overførbarhed og tage forebyggende håndteringsplan 2. Formål med Studiet:

1. Generelle mål: Primære mål er rettet mod at udvikle multipleks realtids revers transkriptionspolymerasekædereaktion (rRT-PCR) for at påvise SARS-CoV-2.

2. Sekundære mål: For den bedste RT-PCR-ydelse bør kombinationen af ​​E- og N-genmål optimeres.

   3. Metode: 3.1. Undersøgelsestype og formål: Dette er et case-kontrol- og observationsstudie, hvor to eksisterende grupper frosne og friske prøver identificeres og sammenlignes.

   3.2. Studiested:

   • Institut Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR)
   • FRK. Clinical Research Organisation Ltd 3.3. Prøveindsamlingssted(er):
   • Institut Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) eller
   • National Institute of Laboratory Medicine & Referral Center (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Studiets varighed: • 3 måneder (november 2021 til januar 2022) efter at have fået etisk godkendelse fra Bangladesh Medical Research Council.

   3.5. Studiepopulation/stikprøveudvælgelse 3.5.1 CRO vil modtage testprøver fra IEDCR. IEDCR og BCTL/CROL som CRO har memorandum of understanding (MoU) for forskelligt forskningssamarbejde. Så NILMRC/BCTL/CROL vil modtage i alt 120 prøver fra IEDCR til evaluering af RT-PCR kit-effektiviteten. Af de 120 prøver vil 60 blive opbevaret prøver (30 COVID-19 kendte positive og 30 COVID-19 negative prøver), som er blevet opbevaret i -80°C laboratoriefrysere på IEDCR faciliteter og yderligere 60 friske prøver (30 COVID-19 positive) og 30 COVID-19 negative prøver), som testes hos IEDCR. Prøver med uoverensstemmende resultater vil blive afvist før testning med BRiCM RT PCR kit. Det vil sige, at mere end 120 identificerede prøver fra IEDCR kan være nødvendige for at analysere med importerede RT-PCR-kits og ekstraktionssæt ved BCTL/CROL. Sådan vil 120 prøver blive udvalgt til præstationsevaluering af BRiCM RT-PCR kit.

   3.5.2 For at undgå partiskhed og interessekonflikter vil sponsor og PI/co-investigatorer blive blindet over for prøve-id'et og positiv/negativ status for prøverne og patienternes kliniske optegnelser. Den positive/negative status for både lagrede og friske prøver vil blive identificeret ved IEDCR før afsendelse til BCTL/CROL. Det vil sige, at BCTL/CROL-personale også vil blive blindet til prøveidentitetsdokument (ID) og positiv negativ/negativ status før analyse. Endelig sender CRO-lederen præstationsevalueringscertifikatet til PI eller sponsor.

   3.5.3. Statistisk grundlag for prøvestørrelse:

   Formler:

   Undersøgelsen er udført på 120 deltagere (60 lagrede kendte positive & negative og 60 friske kendte positive & negative). For at opnå den ønskede absolutte nøjagtighed (n) ved estimering af effektiviteten af ​​RT-PCR er den mindste prøvestørrelse estimeret efter den diskrete Bernoulli-sandsynlighedsfunktion som følger:

   Alfa= 5 % D= absolut nøjagtighed (%) med 95 % sikkerhed. Ønsket absolut nøjagtighed n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* Kvadratrod (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 1009 1009 120 8% 8. 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% 3,6 Prøveudvælgelseskriterier 1. Prøveudvælgelseskriterier1-P3-3 resultater med C. 3.6 Prøveudvælgelseskriterier 1-3. gener hos IEDCR vil blive udvalgt som COVID-19 positive. Prøver med negative RT-PCR-resultater uden amplifikation for COVID-19-generne ved IEDCR vil blive udvalgt som COVID-19.

   • Køn: Alle
   • Alder: 5 til 70 år (barn, voksen, ældre voksen) 7.8.2. Eksklusionskriterier
   • Prøver med tvetydige/tvetydige RT-PCR-resultater med hensyn til sigmoidal kurve og Ct-værdi vil blive udelukket.

   Der kræves ikke samtykke fra patienterne, fordi CRO vil modtage prøverne fra IEDCR i henhold til MOU med IEDCR. Så der er ikke krav om patientens tilmelding og samtykker og CRF fra CRO-siden.

   3.7 Dataindsamlingsprocedure: COVID-19 positive prøver vil blive bekræftet af laboratoriefund af positive RT-PCR-resultater for det virale RNA.

   3.8 Dataanalyse: Følsomheden, specificiteten, den positive forudsigende værdi og den negative forudsigende værdi af BRiCM COVID-19 real-time RT-PCR kit vil blive bestemt. Chi-kvadrat-testen (tosidet) vil blive udført for at sammenligne kategoriske variable. En p-værdi på ≤0,05 vil blive betragtet som niveauet af signifikant association. Udover sensitivitet, specificitet, positiv prædiktiv værdi og negativ prædiktiv værdi, vil Kappa-koefficient, positivt sandsynlighedsforhold og negativt sandsynlighedsforhold også blive beregnet.

   3.9 Databasen er sikret mod uautoriseret adgang af etablerede sikkerhedsprocedurer; passende sikkerhedskopier af databasen og relaterede softwarefiler skal vedligeholdes. Databaser sikkerhedskopieres af databaseadministratoren i forbindelse med eventuelle opdateringer eller ændringer af databasen.

   3.10 Investigator skal gøre undersøgelsesdata tilgængelige for monitoren og autoriserede repræsentanter. Investigator skal levere foreløbig undersøgelsesrapport med data hver tredje måned til den primære investigator. I henhold til krav kan undersøgelsesrapport og data leveres til Bangladesh Medical Research Council (BMRC) og Generaldirektoratet for Drug Administration (DGDA). Efterforskeren skal sikre pålideligheden og tilgængeligheden af ​​kildedokumenter.

   3.11 Overvågningsbesøg vil blive gennemført af principinvestigator, co-investigator samt repræsentanter i henhold til retningslinjer for god klinisk praksis (GCP).

   3.12 For at bevare emnets fortrolighed er det kun et stedsnummer, emnenummer og emneinitialer, der identificerer alle forsøgspersoner på Case Records Forms (CRF) og anden dokumentation, der er indsendt til investigator. Yderligere emnefortrolighedsspørgsmål (hvis relevant) er dækket af aftalen om klinisk undersøgelse.

   3.13 Alle optegnelser vil blive holdt hemmelige for PI, co-investigators, sponsor undtagen IEDCR-ansvarlige personer, der er ansvarlige. Prøver vil blive identificeret som kode/ID-nummer og dato hos IEDCR, før de sendes til BCTL/Contact Research Organisation Limited (CROL) 4. Til denne undersøgelse har det nævnte institut IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. udføre det kliniske forsøg for at finde ud af kittets effektivitet gennem deres eksisterende ressource. Udover det kan CRO administrere kemikaliet, reagenset og teknologien, hvis det er nødvendigt for undersøgelsen i henhold til MoU mellem finansieringsbureauer.

   5. Interessekonflikt BRiCM er finansieringsorganet for det foreslåede COVID-19 RT-PCR-kit, er et lovpligtigt organ, der fungerer under administrativ kontrol af Ministeriet for Videnskab og Teknologi. Det er en forskningsorganisation og et referenceinstitut inden for kemiske målinger. Det er hverken en kommerciel virksomhed eller en overskudsgivende organisation. I henhold til forfatningsmæssige sanktioner er BRiCM's hovedansvar at videreføre forskning, der fører til sådan innovation, som vil tilføje værdi til regeringens indsats for at sikre befolkningens velfærd.