VOC i udåndingsprøver til diagnosticering af IPA

BAGGRUND Diagnosen invasiv pulmonal aspergillose (IPA) har alvorlige konsekvenser for prognosen og behandlingsplanen for den immunsupprimerede patient. Den allestedsnærværende tilstedeværelse af Aspergillus spp i miljøet, og i forlængelse heraf - allestedsnærværende af sådanne isolater i åndedrætssystemet hos raske forsøgspersoner, udgør en stor diagnostisk udfordring. Differentieringen af ​​IPA fra ikke-invasiv kolonisering af luftvejene kan nemlig være udfordrende. Den store stigning i prævalensen af ​​patienter, der er immunsupprimerede, herunder maligniteter og onkologiske behandlinger, hæmatopoietiske stamceller og solide organtransplantationer og immunmodulerende medicin, fremhæver dette dilemma.(1) Især patienter med akut myelogen leukæmi (AML) har høj risiko for at udvikle IPA, hvor 5-15 % af sådanne patienter udvikler IPA i løbet af de første 3 måneder efter AML-diagnose.(1-3). Da op til 5 % af patienter med AML kan have IPA ved præsentationen, gennemgår patienter indlagt på Rambam Medical Center (RMC) med en ny diagnose af AML rutinemæssigt thorax computertomografi (CT), som tjener som screening for tilstedeværelsen af ​​IPA ved diagnosen og en baseline for yderligere reference, hvis IPA senere mistænkes.(3) Diagnose af sandsynlig eller dokumenteret IPA hos en AML-patient kræver suggestive billeddiagnostiske fund sammen med mikrobiologiske beviser. Mens diagnosen i nogle tilfælde kan stilles ved hjælp af biomarkører (hovedsageligt d-galactomannan-antigenet og eller Aspergillus spp-polymerasekædereaktion) i perifert blod, er følsomheden af ​​disse assays lav, og ofte giver denne minimalt invasive tilgang ikke tilstrækkelig diagnostisk sikkerhed. I sådanne tilfælde udføres normalt bronkoskopi med bronkoalveolær lavage. Denne invasive procedure er særlig farlig hos patienter med mistanke om IPA, hvoraf langt de fleste er meget skrøbelige på grund af deres underliggende sygdom.(4) Disse overvejelser har ført til søgen efter yderligere, ikke-invasive modaliteter til diagnosticering af IPA. (5) En sådan tilgang har været analyse af flygtige organiske forbindelser (VOC) i udåndingsluftprøver. Karakteriseret ved lavt damptryk ved stuetemperatur er VOC-profilanalyse af udåndingsluft et spirende område inden for diagnostik, med potentialet for ikke-invasiv screening og diagnosticering af forskellige sygdomme, herunder neoplasmer,(6), infektioner(7) og inflammatoriske processer. (8) Tidligere undersøgelser har identificeret potentielle VOC-markører for metabolisk aktive Aspergillus spp,(9) med en lille prospektiv undersøgelse hos mennesker(10), der viser opmuntrende diagnostisk ydeevne for VOC-baseret IPA-identifikation. Disse forsøg er dog blevet hæmmet af flere faldgruber. For det første ser VOC-profiler af in vitro Aspergillus spp ud til at have ringe sammenhæng med VOC'er fundet i udåndingsanalyse af koloniserede patienter.(5) For det andet har udåndede VOC'er en tendens til at variere meget mellem individer, hvilket gør fraværet af tidsmæssige kontroller (dvs. VOC-profilændringer hos det samme individ før og efter IPA-udvikling) til en afgørende advarsel.(10) For det tredje, så vidt vi ved, har ingen longitudinelle undersøgelser vurderet VOC-profilers respons på IPA-behandling.

I denne prospektive longitudinelle undersøgelse sigter vi mod at overvinde disse forhindringer ved at udnytte to nøglekarakteristika for hæmatologiske patienter behandlet i RMC. For det første har patienter med nydiagnosticeret AML en relativt høj forekomst af IPA. For det andet udføres en bryst-CT ved diagnosen AML hos alle patienter. Indsamling af udåndingsprøver fra patienter med normal baseline CT vil således tjene som negative kontroller, hvilket giver mulighed for sammenligning af VOC-profiler før og efter udviklingen af ​​IPA hos den samme patient. Yderligere prøvetagning, efter at patienten er kommet sig efter IPA, vil give yderligere langsgående kontrol.

MÅL Identifikation af VOC-profiler, der forudsiger IPA i udåndingsprøver

METODER

Studere design:

Dette er et enkelt center, ikke-randomiseret, prospektivt kohortestudie. Åndedrætsprøver fra samtykkende patienter vil blive analyseret for VOC-profiler på tidspunktet for den indledende CT-screening for IPA. Derudover vil der også blive indsamlet prøver på tidspunktet for diagnosticering af enhver mulig, sandsynlig eller bekræftet IPA (defineret i henhold til EORTC-kriterierne (4) som beskrevet nedenfor).

Indstilling og deltagere:

Patienter nydiagnosticeret med AML, der påbegynder behandling på RMC hæmatologisk afdeling, vil blive kontaktet. Inklusionsperioden vil være fra 1. oktober 2022 til 31. marts 2025.

Inklusionskriterier:

Ny diagnose af akut myeloid leukæmi OG/ELLER planlagt hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HCT) Bryst-CT udført inden for 30 dage fra prøvetagning 18 år eller ældre Evnen til at give tidevandsåndeprøver på i alt 10L direkte i en Tedlar-pose

Eksklusionskriterier:

Enhver tilstand, der forringer patientens evne til at give informeret samtykke

Prøvesamling:

Åndedrætsprøver vil blive indsamlet i en af ​​vores hæmatologiske afdelings 23 dedikerede hospitalsrum - positivt tryk og klimastyret med E-rene højeffektive partikelluft (HEPA) filtre (ADS-Laminaire, Israel). Patienter vil blive bedt om at afholde sig fra tandbørstning, tandvask, spisning, drikke eller rygning i de 6 timer før prøvetagning. Efter at have siddet i 10 minutter (for at undgå træningsinduceret stigning i isoprenkoncentrationen (11) ), vil patienten blive bedt om at fylde 10 L tidevandsånde i en tedlar-pose (SKC, Sydkorea). Samtidig skal en identisk tedlarpose fyldes med omgivende luft.

Ved hver prøveindsamling vil følgende data blive registreret:

Patientens karakteristika, herunder alder, hæmato-onkologisk diagnose, tid fra første diagnose, aktuel behandling, tid fra HCT, hvis det er relevant, baggrundsdiagnoser Aktuel farmakologisk behandling, herunder alle antibiotika og svampedræbende midler ordineret den foregående måned.

Aktuelle diagnostiske tests, inklusive alle kulturer, serologiske assays, nukleinsyreamplifikationsundersøgelser, fuldstændig blodtælling og kemi, voriconazol plasmaniveau og brystbilleddannelse udført i løbet af den seneste måned.

Prøvehåndtering og VOC-ekstraktion:

Alle tedlar poser vil blive opbevaret ved 4 ℃ efter afhentning. Adsorption på 2 parallelle termiske desorptionsrør skal udføres via Gilian LFS-113 Low Flow Personal Air Sampling Pump (SRA instrumenter, Milano, Italien), udført inden for 72 timer efter prøvetagning og opbevaret under omgivende forhold. Disse prøver vil blive mærket (kodet) og omdannet til Environmental Chemistry Laboratory (Kasali Institute of Chemistry, Hebraw University of Jerusalem, Israel)

Analytics:

Termisk desorption vil blive opnået ved 290°C i 20 minutter under anvendelse af heliumgas af analytisk kvalitet (99,999%) som bærer. Injektion til tandemgaskromatografi-massespektroskopi (GC-MS) skal udføres ved lignende indgangstemperaturer, der ikke overstiger flowet på 40 ml/min. Det indledende GC-temperaturprogram vil efterligne tidligere rapporterede (10) protokoller: 40˚C i 3 minutter, hævet til 70˚C med en hastighed på 5˚C pr. minut og holdt i 3 minutter, hævet til 203˚C ved 7˚C minut og holdt i 4 minutter, hæves hurtigt til 270˚C og holdt i 5 minutter. Et tredobbelt quad massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) skal forbindes i tandem med et massemålingsområde på 20-400 m/z.

Diagnosen invasiv pulmonal aspergillose vil blive defineret i henhold til de opdaterede EORTC-kriterier (4) som en af ​​følgende:

Bekræftet IPA defineret som en respiratorisk biopsiprøve med positiv kultur af Aspergillus spp eller histopatologisk påvisning af vævsinvasion med hyfer.

"Sandsynlig IPA", defineret (1) som kompatible radiografiske træk på bryst-CT (tæt, velomskrevne læsion(er) med eller uden et halo-tegn, luft-halvmåne-tegn eller et hulrum) og en eller flere af følgende: Bevis for Aspergillus spp efter cytologi, direkte mikroskopi eller kultur fra enhver respiratorisk prøve, inklusive sputum, broncho-alveolær lavage (BAL) væske eller bronchial børste Positivt D-galactomannan antigen påvist i plasma, serum eller BAL væske Positiv polymerase kædereaktion (PCR) for Aspergillus spp påvist i plasma, serum eller BAL-væske "Mulig IPA", defineret (1) som kompatible radiografiske træk på bryst-CT (tæt, velomskrevne læsion(er) med eller uden et halo-tegn, luft-halvmåne-tegn eller et hulrum ) uden bekræftende laboratoriefund.

Yderligere oplysninger vedrørende sandsynligheden for IPA-diagnose vil blive indsamlet af to uafhængige observatører (I.G. og A.S.), der gennemgår den fulde elektroniske lægejournal (EMR) ved slutningen af ​​undersøgelsesperioden, og tildeler en enkelt sandsynlighedsscore 1-10 (1 er meget lavt) sandsynlighed for IPA, 10 svarende til næsten sikker IPA) i lyset af sygdommens fulde kliniske forløb.

Yderligere variabler og datakilder: For alle kohortepatienter vil epidemiologiske og kliniske oplysninger blive udtrukket fra hospitalets elektroniske journalsystem (EMR) brugt på vores hospital hentet ved hjælp af MD-clone softwaren. Vi bliver nødt til at indhente de personlige oplysninger om patienter for at få adgang til deres data, der er registreret i den daglige opfølgning i deres lægeskema, da nogle data ikke er kodet. Alle data skal senere kodes og fjernes fra eventuelle personlige identifikatorer, herunder navn, efternavn, fødselsdato, ID-nummer og adresse. Alle data skal opbevares på en udpeget harddisk i hænderne på den primære efterforsker. Datakilder vil omfatte patientens fil på "prometheus" EMR-registret samt hentede data ved hjælp af MD-klonsoftware. Indsamlede data vil omfatte: demografi (alder, køn), baggrundsdiagnoser, varighed af ophold og overførsel til andre enheder, laboratorieresultater, registrerede vitale tegn og den anvendte iltningsmetode som dokumenteret i den daglige opfølgning.

Prøveindsamlingsplan: Den første prøve af samtykkende patienter inkluderet i denne undersøgelse vil blive indsamlet inden for 7 dage fra baseline thorax-CT. Efterfølgende, efter enhver klinisk mistanke om IPA hos den behandlende læge - en mistanke, der uvægerligt fører til, at en thorax-CT bliver udført, vil prøver blive indsamlet inden for 7 dage fra thorax-CT. Yderligere prøver vil blive indsamlet inden for 7 dage fra den behandlende læges afbrydelse af antifungal behandling. Prøveudtagningsplanen er visualiseret i figur 1.

Figur 1 - Prøveudtagningsstrategi. Denne undersøgelses intervention er begrænset til prøveudtagning understreget med fed rød - alle andre trin er en del af den sædvanlige behandling af AML-patienter og er på ingen måde påvirket af deltagelsen i denne undersøgelse. AML - Akut Myeloid Leukæmi; Dx - Diagnose; CT - computertomografi; IPA - Invasiv pulmonal aspergillose; Tx - Behandling; d/c - udgået; GGO - Ground Glass Opacities.

Datahåndtering og statistisk analyse:

Kliniske data skal analyseres ved hjælp af beskrivende statistikker, parametriske og ikke-parametriske tests efter behov. Al statistisk analyse skal udføres med R-softwareversion 4.0.0 ("Arbor day") eller senere. Alle identificerbare data, inklusive patientens baseline-karakteristika, laboratorie- og billeddannelsesresultater og tidligere diagnoser og behandlingsjournaler, skal opbevares af den primære investigator på en udpeget RAS-krypteret fastfasehukommelsesenhed i hele undersøgelsens varighed. Patientens navne, ID-numre, adresse og fødselsdato vil ikke blive gemt.

Massespektroskopi-output vil blive gennemgået ved hjælp af MassHunter-arbejdsstationen og software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Delvis mindste kvadraters diskriminationsanalyse vil blive udført ved hjælp af SIMCA-softwareversion 14.0 eller nyere (MKS Umetrics, Sverige). For hvert m/z-område vil der blive konstrueret en logistisk regressionsmodel, som giver mulighed for beregning af den variable betydning for projektion (VIP). For alle VIP'er ≥1 vil den tilsvarende ionprofil blive valgt som et potentielt mål. Disse vil blive sammenlignet med tidligere implicerede metabolitter, der indikerer IPA, (10,11) samt vores eksisterende database, som opsummeret i APPENDIKS A. En sådan identifikation er afgørende, da den samme m/z-værdi kan svare til forskellige metabolitter, som forskellige stoffer kan have det samme kimplasma ladningsforhold. Dernæst vil alle identificerede stoffer blive bekræftet mod National Institute of Standards and Technology (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) og en ren kemisk standard. Endelig vil den digitale matrix, der er sammensat af de udvalgte karakteristiske VOC'er, blive importeret til python (version 3.10.5 eller nyere) for at konstruere forskellige klassifikationsmodeller, med prædiktive præstationer vurderet ved binær logistisk regression. Korrelationerne mellem udåndede VOC-ekspressionsniveauer og niveauer af serum og BAL d-gallactomannan og IPA diagnostisk sikkerhed (bekræftet, sandsynlig eller mulig, som defineret nedenfor) vil blive opnået ved hjælp af Persons r.

Prøvestørrelse og kraft:

I denne prospektive longitudinelle undersøgelse vil patienter med høj sandsynlighed for at udvikle IPA (dvs. patienter diagnosticeret med akut leukæmi) blive indskrevet ved diagnosen. Da vores center udfører baseline-thorax-CT-screening for at identificere potentiel IPA ved baseline, kan VOC opsamlet efter normal radiografi tjene som rigelig kontrol. Mindst 15 % af sådanne patienter udvikler IPA i de efterfølgende måneder(3), hvilket begrænser den stikprøvestørrelse, der er nødvendig ved rekruttering. Baseret på tidligere rapporteret overholdelse af opfølgning (12) forventer vi, at frafaldsraten er lav, hvilket giver mulighed for påvisning af tidligere uhåndgribelige ændringer efter behandling i VOC-profiler.

Til formålet med disse beregninger antog vi den tidligere rapporterede VOC-assays følsomhed (sammenlignet med mikrobiologi eller antigentest i respiratoriske sekreter, BAL eller patientserum) på 80-95 % hver.(10) Nylige retrospektive undersøgelser har identificeret forekomsten af ​​IPA til at være 5 % ved indledende screening CT og yderligere 10 % inden for den indledende indlæggelse.(3) Dette udmønter sig i en estimeret stikprøvestørrelse på 124 patienter, beregnet under antagelsen om den accepterede signifikans (alfa = 0,05) og power (beta = 0,8). Hvis der tages højde for en anslået 70 % tilmelding og den yderligere 15 % udelukkelsesrate, er den samlede estimerede stikprøvestørrelse 208 patienter. Ved at fremskrive den gennemsnitlige årlige forekomst af 90 nye tilfælde af akut leukæmi behandlet på vores hospital, skulle dette prøveudtagningsmål let kunne nås inden for den forudbestemte 30 måneders rekrutteringsperiode. Vi forventer således, at deltagerantallet bliver 300.

ETISKE OVERVEJELSER Udvikling og forbedring af ikke-invasive teknikker til IPA-identifikation har været det erklærede mål for forskellige professionelle selskaber i over to årtier. (1,4) Det diagnostiske værktøj, der foreslås af patienterne, har minimal eller ingen gener for deltagerne, og vi anser potentielle bivirkninger og farer for at være ubetydelige i denne helt ikke-invasive modalitet.

Efter dataudtræk skal alle data fratages enhver identifikation, herunder navn, efternavn, ID-nummer, sagsnummer, fødselsdato og adresse - alt sammen destrueret, når den første dataudtrækning er afsluttet. Data skal opbevares sikkert på en RAS-krypteret, udpeget SD-enhed i hænderne på PI, hvilket minimerer sandsynligheden for, at denne undersøgelse påvirker databeskyttelse eller medicinsk fortrolighed for de inkluderede patienter. I lyset af den direkte effekt, som resultaterne af denne undersøgelse kan have på ledelsen og prognosen for de alvorligt syge, finder vi, at fordelene ved denne undersøgelse opvejer eventuelle potentielle risici.

Finansiering Der er indtil videre ikke givet ekstern finansiering til denne undersøgelse.

Bibliografi

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. En klinisk algoritme til diagnosticering af invasiv pulmonal aspergillose hos kritisk syge patienter. Am J Respir Crit Care Med. 1. juli 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiologi af invasiv svampesygdom hos hæmatologiske patienter. Mykoser. 2021 Mar;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y, et al. Baseline Chest Computed Tomography til tidlig diagnose af invasiv pulmonal aspergillose hos hæmato-onkologiske patienter: en prospektiv kohorteundersøgelse. Clin Infect Dis. 2019 30. okt;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Revision og opdatering af konsensusdefinitionerne af invasiv svampesygdom fra den europæiske organisation for forskning og behandling af kræft og mycoses studiegruppens uddannelses- og forskningskonsortium. Clin Infect Dis. 2020 12. september;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nye banebrydende metabolit-baserede diagnostiske værktøjer til aspergillose. PLoS Pathog. 7. september 2017;13(9):e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K, et al. Udforskning af flygtige organiske forbindelser i vejret for at forudsige lungekræft med høj nøjagtighed. Kræft (Basel). 2021 Mar 21;13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Virusinducerede flygtige organiske forbindelser kan påvises i udåndet åndedræt under lungeinfektion. Am J Respir Crit Care Med. 2021 Nov 1;204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Forudsigelse af astma ved hjælp af kliniske indekser. Front Pediatr. 31. juli 2019; 7:320.
9. Das S, Pal M. Review-Non-Invasive Monitoring of Human Health by Exhaled Breath Analysis: A Comprehensive Review. J Electrochem Soc. 3. februar 2020;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et al. En sekundær åndedrætssvampemetabolitsignatur til diagnosticering af invasiv aspergillose. Clin Infect Dis. 2014 Dec 15;59(12):1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y, et al. Udåndede flygtige organiske forbindelser til identifikation af patienter med kronisk pulmonal aspergillose. Front Med (Lausanne). 2021 23. september; 8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostisk rolle af polymerasekædereaktion i bronchoalveolær lavagevæske for invasiv pulmonal aspergillose hos immunkompromitterede patienter - En retrospektiv kohorteundersøgelse. Int J Infect Dis. Jun 2019;83:20-5.