VOC in campioni di respiro per la diagnosi di IPA

BACKGROUND La diagnosi di aspergillosi polmonare invasiva (IPA) comporta gravi implicazioni per la prognosi e il piano di trattamento del paziente immunodepresso. L'onnipresenza di Aspergillus spp nell'ambiente e, per estensione, l'ubiquità di tali isolati nel sistema respiratorio di soggetti sani, pone una grande sfida diagnostica. Vale a dire, la differenziazione dell'IPA dalla colonizzazione non invasiva delle vie respiratorie può essere difficile. Il vasto aumento della prevalenza di pazienti immunodepressi, inclusi tumori maligni e trattamenti oncologici, cellule staminali ematopoietiche e trapianti di organi solidi e farmaci immunomodulatori, accentua questo dilemma.(1) In particolare, i pazienti con leucemia mieloide acuta (AML) sono ad alto rischio di sviluppare IPA, con il 5-15% di tali pazienti che sviluppano IPA durante i primi 3 mesi dopo la diagnosi di AML.(1-3) Poiché fino al 5% dei pazienti con leucemia mieloide acuta può presentare IPA alla presentazione, i pazienti ricoverati al Rambam Medical Center (RMC) con una nuova diagnosi di leucemia mieloide acuta vengono sottoposti di routine alla tomografia computerizzata (TC) del torace, che funge da screening per la presenza di IPA alla diagnosi e una base di riferimento per ulteriori riferimenti nel caso in cui si sospetti l'IPA in seguito.(3) La diagnosi di IPA probabile o provata in un paziente con LMA richiede risultati di imaging suggestivi insieme a prove microbiologiche. Sebbene in alcuni casi la diagnosi possa essere effettuata utilizzando biomarcatori (principalmente l'antigene d-galattomannano e/o la reazione a catena della polimerasi di Aspergillus spp) nel sangue periferico, la sensibilità di questi test è bassa e spesso questo approccio minimamente invasivo non fornisce sufficiente certezza diagnostica. In tali casi, di solito viene eseguita la broncoscopia con lavaggio broncoalveolare. Questa procedura invasiva è particolarmente pericolosa nei pazienti con sospetta IPA, la stragrande maggioranza dei quali è molto fragile a causa della malattia di base.(4) Queste considerazioni hanno portato alla ricerca di ulteriori modalità non invasive nella diagnosi di IPA. (5) Uno di questi approcci è stata l'analisi dei composti organici volatili (COV) in campioni di aria espirata. Caratterizzata da bassa pressione di vapore a temperatura ambiente, l'analisi del profilo VOC dell'aria espirata è un campo diagnostico emergente, con il potenziale di screening e diagnosi non invasivi di varie malattie, tra cui neoplasie,(6) infezioni(7) e processi infiammatori. (8) Precedenti studi hanno identificato potenziali marcatori VOC di Aspergillus spp metabolicamente attivo,(9) con un piccolo studio prospettico nell'uomo(10) che mostra prestazioni diagnostiche incoraggianti per l'identificazione di IPA basata su VOC. Tuttavia, questi tentativi sono stati ostacolati da diverse insidie. In primo luogo, i profili COV di Aspergillus spp in vitro sembrano avere poca relazione con i COV trovati nell'analisi del respiro di pazienti colonizzati.(5) In secondo luogo, i VOC espirati tendono a differire notevolmente tra gli individui, rendendo l'assenza di controlli temporali (ovvero, i cambiamenti del profilo VOC nello stesso individuo prima e dopo lo sviluppo dell'IPA) un avvertimento cruciale.(10) In terzo luogo, a nostra conoscenza nessuno studio longitudinale ha valutato la risposta dei profili VOC al trattamento con IPA.

In questo studio prospettico longitudinale miriamo a superare questi ostacoli sfruttando due caratteristiche chiave dei pazienti ematologici trattati in RMC. In primo luogo, i pazienti con LMA di nuova diagnosi hanno una prevalenza relativamente elevata di IPA. In secondo luogo, alla diagnosi di leucemia mieloide acuta viene eseguita una TC del torace in tutti i pazienti. Pertanto, la raccolta di campioni di respiro da pazienti con CT basale normale fungerà da controllo negativo, consentendo il confronto dei profili VOC prima e dopo lo sviluppo di IPA nello stesso paziente. Un ulteriore campionamento dopo che il paziente si è ripreso dall'IPA fornirà un ulteriore controllo longitudinale.

OBIETTIVI L'identificazione di profili VOC predittivi di IPA in campioni di respiro

METODI

Disegno dello studio:

Questo è uno studio di coorte prospettico a centro singolo, non randomizzato. I campioni di respiro di pazienti consenzienti saranno analizzati per i profili VOC al momento dello screening TC iniziale per IPA. Inoltre, i campioni saranno raccolti anche al momento della diagnosi di qualsiasi IPA possibile, probabile o confermato (definito secondo i criteri EORTC (4) come dettagliato di seguito).

Ambientazione e partecipanti:

Saranno contattati i pazienti con nuova diagnosi di AML che iniziano il trattamento nel reparto di ematologia RMC. Il periodo di inclusione sarà dal 1 ottobre 2022 al 31 marzo 2025.

Criterio di inclusione:

Nuova diagnosi di leucemia mieloide acuta E/O trapianto pianificato di cellule staminali ematopoietiche (HCT) TC del torace eseguita entro 30 giorni dal prelievo 18 anni di età o più La capacità di fornire campioni di respiro tidal per un totale di 10 litri direttamente in una sacca Tedlar

Criteri di esclusione:

Qualsiasi condizione che comprometta la capacità del paziente di fornire il consenso informato

Raccolta campioni:

I campioni di respiro verranno raccolti in una delle 23 sale di degenza dedicate del nostro dipartimento ematologico, pressurizzate positivamente e climatizzate con filtri HEPA (High-Efficiency Particulate Air) E-pure (ADS-Laminaire, Israele). Ai pazienti sarà richiesto di astenersi dal lavarsi i denti, lavarsi i denti, mangiare, bere o fumare nelle 6 ore precedenti la raccolta del campione. Dopo essere stato seduto per 10 minuti (per evitare l'aumento della concentrazione di isoprene indotto dall'esercizio (11)), al paziente verrà chiesto di riempire 10 litri di alito di marea in una borsa tedlar (SKC, Corea del Sud). Simultaneamente, un sacco di tedlar identico deve essere riempito con aria ambiente.

Ad ogni prelievo di campione verranno registrati i seguenti dati:

Caratteristiche del paziente, inclusa età, diagnosi emato-oncologica, tempo dalla diagnosi iniziale, trattamento in corso, tempo dall'HCT se applicabile, diagnosi di base Trattamento farmacologico in corso, inclusi tutti gli antibiotici e gli antimicotici prescritti il ​​mese precedente.

Test diagnostici attuali, comprese tutte le colture, test sierologici, studi di amplificazione dell'acido nucleico, emocromo completo e chimica, livello plasmatico di voriconazolo e imaging del torace eseguiti nell'ultimo mese.

Manipolazione dei campioni ed estrazione dei COV:

Tutti i sacchi di tedlar saranno conservati a 4℃ dopo la raccolta. L'adsorbimento su 2 tubi paralleli di desorbimento termico deve essere effettuato tramite la pompa di campionamento dell'aria personale a basso flusso Gilian LFS-113 (strumenti SRA, Milano, Italia), eseguita entro 72 ore dal campionamento e conservata in condizioni ambientali. Questi campioni saranno etichettati (codificati) e trasformati nel laboratorio di chimica ambientale (Kasali Institute of Chemistry, Hebrew University of Jerusalem, Israel)

Analisi:

Il desorbimento termico verrà effettuato a 290 per 20 minuti utilizzando elio gassoso di grado analitico (99,999%) come vettore. L'iniezione alla spettroscopia di massa gascromatografica in tandem (GC-MS) deve essere eseguita a temperature di ingresso simili non superiori al flusso di 40 mL/min. Il programma di temperatura iniziale del GC imiterà i protocolli (10) riportati in precedenza: 40˚C per 3 minuti, aumentata a 70˚C a una velocità di 5˚C al minuto e mantenuta per 3 minuti, aumentata a 203˚C a 7˚C al minuto e mantenuto per 4 minuti, portato rapidamente a 270˚C e mantenuto per 5 minuti. Uno spettrometro di massa triplo quadruplo (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) sarà collegato in tandem, con un intervallo di misurazione della massa di 20-400 m/z.

La diagnosi di aspergillosi polmonare invasiva sarà definita secondo i criteri EORTC aggiornati (4) come uno dei seguenti:

IPA confermato definito come un campione di biopsia respiratoria con coltura positiva di Aspergillus spp o dimostrazione istopatologica di invasione tissutale da parte delle ife.

"Probabile IPA", definita (1) come caratteristiche radiografiche compatibili sulla TC del torace (lesione/i densa/e ben circoscritta/e con o senza segno di alone, segno di mezzaluna d'aria o cavità) e uno qualsiasi dei seguenti: Evidenza di Aspergillus spp su citologia, microscopia diretta o coltura da qualsiasi campione respiratorio, incluso espettorato, fluido di lavaggio bronco-alveolare (BAL) o pennello bronchiale Antigene D-galattomannano positivo rilevato nel plasma, siero o fluido BAL Reazione a catena della polimerasi positiva (PCR) per Aspergillus spp rilevato nel plasma, nel siero o nel fluido BAL "Possibile IPA", definito (1) come caratteristiche radiografiche compatibili alla TC del torace (lesione/i densa/e ben circoscritta/e con o senza segno di alone, segno di mezzaluna d'aria o cavità ) senza risultati di laboratorio corroboranti.

Ulteriori informazioni sulla probabilità di diagnosi di IPA saranno raccolte da due osservatori indipendenti (I.G. e A.S.) che esamineranno l'intera cartella clinica elettronica (EMR) alla fine del periodo di studio, assegnando un singolo punteggio di probabilità da 1 a 10 (1 è molto basso probabilità di IPA, 10 corrispondente a IPA quasi certo) in considerazione del decorso clinico completo della malattia.

Ulteriori variabili e fonti di dati: per tutti i pazienti della coorte, le informazioni epidemiologiche e cliniche saranno estratte dal sistema di cartelle cliniche elettroniche (EMR) dell'ospedale utilizzato nel nostro ospedale recuperato con l'assistenza del software MD-clone. Avremo bisogno di ottenere le informazioni personali dei pazienti per poter accedere ai loro dati registrati nel follow-up giornaliero nella loro cartella clinica poiché alcuni dati non sono codificati. Tutti i dati saranno successivamente codificati e privati ​​di qualsiasi identificativo personale, inclusi nome, cognome, data di nascita, numero di identificazione e indirizzo. Tutti i dati devono essere archiviati su un disco rigido designato nelle mani del ricercatore principale. Le fonti di dati includeranno il file del paziente sul registro EMR "prometheus" e i dati recuperati utilizzando il software MD-clone. I dati raccolti includeranno: dati demografici (età, sesso), diagnosi di base, durata della degenza e trasferimento ad altre unità, risultati di laboratorio, segni vitali registrati e metodo di ossigenazione utilizzato come documentato nel follow-up quotidiano.

Programma di raccolta del campione: il primo campione di pazienti consenzienti inclusi in questo studio verrà raccolto entro 7 giorni dalla TC del torace al basale. Successivamente, a seguito di qualsiasi sospetto clinico di IPA da parte del medico curante - un sospetto che porta invariabilmente all'esecuzione di una TC del torace, i campioni saranno raccolti entro 7 giorni dalla TC del torace. Ulteriori campioni saranno raccolti entro 7 giorni dall'interruzione del trattamento antimicotico da parte del medico curante. Il programma di campionamento, sono visualizzati in figura 1.

Figura 1 - Strategia di campionamento. L'intervento di questo studio è limitato al campionamento sottolineato in grassetto rosso - tutti gli altri passaggi fanno parte della normale gestione dei pazienti affetti da LMA e non sono in alcun modo influenzati dalla partecipazione a questo studio. AML - Leucemia mieloide acuta; Dx - Diagnosi; TC - Tomografia computerizzata; IPA - Aspergillosi Polmonare Invasiva; Tx - Trattamento; d/c - interrotto; GGO - Opacità del vetro smerigliato.

Trattamento dei dati e analisi statistiche:

I dati clinici devono essere analizzati utilizzando statistiche descrittive, test parametrici e non parametrici, a seconda dei casi. Tutte le analisi statistiche devono essere eseguite utilizzando il software R versione 4.0.0 ("Arbor day") o successiva. Tutti i dati identificabili, comprese le caratteristiche basali del paziente, i risultati di laboratorio e di imaging e le precedenti diagnosi e registrazioni del trattamento, devono essere archiviati dallo sperimentatore principale su un dispositivo di memoria a fase solida crittografato RAS designato per la durata dello studio. I nomi dei pazienti, i numeri ID, l'indirizzo e la data di nascita non verranno memorizzati.

I risultati della spettroscopia di massa saranno esaminati utilizzando la workstation e il software MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). L'analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali verrà eseguita utilizzando il software SIMCA versione 14.0 o successiva (MKS Umetrics, Svezia). Per ogni intervallo m/z verrà costruito un modello di regressione logistica che consentirà il calcolo della variabile importanza per la proiezione (VIP). Per tutti i VIP ≥1 il profilo ionico corrispondente sarà selezionato come potenziale target. Questi saranno confrontati con metaboliti precedentemente implicati indicativi di IPA, (10,11) così come con il nostro database esistente, come riassunto nell'APPENDICE A. Tale identificazione è cruciale poiché lo stesso valore m/z può corrispondere a diversi metaboliti, in quanto sostanze diverse può avere lo stesso rapporto di carica del germoplasma. Successivamente, tutte le sostanze identificate saranno confermate rispetto alla Biblioteca spettrale di massa 11 del National Institute of Standards and Technology (NIST) (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) e uno standard chimico puro. Infine, la matrice digitale composta dai VOC caratteristici selezionati sarà importata in Python (versione 3.10.5 o successiva) per costruire diversi modelli di classificazione, con prestazioni predittive valutate mediante regressione logistica binaria. Le correlazioni tra i livelli di espressione di COV nell'espirato ei livelli di d-gallattomannano sierico e BAL e la certezza diagnostica dell'IPA (confermata, probabile o possibile, come definito di seguito) saranno effettuate utilizzando l'r.

Dimensione e potenza del campione:

In questo studio prospettico longitudinale verranno arruolati alla diagnosi pazienti con alta probabilità di sviluppare IPA (cioè pazienti con diagnosi di leucemia acuta). Poiché il nostro centro esegue lo screening TC del torace al basale per identificare potenziali IPA al basale, i VOC raccolti dopo la normale radiografia possono servire come ampi controlli. Almeno il 15% di questi pazienti sviluppa IPA nei mesi successivi,(3) limitando la dimensione del campione necessaria al momento del reclutamento. Sulla base dell'aderenza al follow-up precedentemente riportata, (12) ci aspettiamo che il tasso di abbandono sia basso, consentendo il rilevamento di modifiche post-trattamento precedentemente sfuggenti nei profili VOC.

Ai fini di questi calcoli, abbiamo assunto la sensibilità dei test VOC precedentemente riportati (rispetto ai test microbiologici o antigenici nelle secrezioni respiratorie, BAL o siero del paziente) dell'80-95% ciascuno.(10) Recenti indagini retrospettive hanno identificato che l'incidenza di IPA è del 5% allo screening CT iniziale e di un ulteriore 10% durante il ricovero iniziale.(3) Ciò si traduce in una dimensione stimata del campione di 124 pazienti, calcolata assumendo la significatività accettata (alfa = 0,05) e la potenza (beta = 0,8). Considerando un'iscrizione stimata del 70% e un tasso di esclusione aggiuntivo del 15%, la dimensione totale stimata del campione è di 208 pazienti. Proiettando l'incidenza media annuale di 90 nuovi casi di leucemia acuta trattati nel nostro ospedale, questo obiettivo di campionamento dovrebbe essere facilmente raggiunto entro il periodo di reclutamento di 30 mesi prestabilito. Ci aspettiamo quindi che il numero dei partecipanti sia di 300.

CONSIDERAZIONI ETICHE Lo sviluppo e il miglioramento delle tecniche non invasive per l'identificazione IPA è stato l'obiettivo dichiarato di varie società professionali per oltre due decenni. (1,4) Lo strumento diagnostico proposto dai pazienti comporta un disagio minimo o nullo per i partecipanti e riteniamo che i potenziali effetti collaterali e il pericolo siano trascurabili in questa modalità del tutto non invasiva.

Dopo l'estrazione dei dati, tutti i dati devono essere privati ​​di qualsiasi identificazione inclusi nome, cognome, numero di identificazione, numero del caso, data di nascita e indirizzo - tutti distrutti quando l'estrazione dei dati iniziale è completata. I dati devono essere archiviati in modo sicuro su un dispositivo SD designato crittografato RAS nelle mani del PI, riducendo al minimo la probabilità che questo studio influenzi la privacy dei dati o la riservatezza medica dei pazienti inclusi. Alla luce dell'effetto diretto che i risultati di questa indagine possono avere sulla gestione e sulla prognosi dei malati gravi, riteniamo che i benefici di questo studio superino qualsiasi potenziale rischio.

Finanziamento Finora non sono stati forniti finanziamenti esterni per questo studio.

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