Gezielte Hochdurchsatzsequenzierung bei der Diagnose akuter Leukämie bei Kindern

Akute Leukämien sind eine heterogene Gruppe hämatologischer Malignomen. Sie entstehen durch klonale Expansion unreifer Zellen, deren Anzahl im Knochenmark mehr als 20 % beträgt. Akute Leukämien im Kindesalter sind die häufigsten malignen Erkrankungen im Kindesalter. In Europa und den Vereinigten Staaten machen sie etwa 35 % der Krebserkrankungen im Kindesalter aus. 80 % davon sind akute lymphatische Leukämie (ALL) und 15–20 % akute myeloische Leukämie (AML). Aktuelle Behandlungen ermöglichen eine Heilung in etwa 80 % aller Fälle, während dieser Wert bei AML nur 50 % beträgt. Die Diagnose akuter Leukämie basiert auf der multidisziplinären Untersuchung von Leukämiezellen mit verschiedenen Techniken:

• Zellular: Zytologie, Immunphänotypisierung und Zytochemie
• Zytogenetisch: konventionelle (Karyotyp) und molekulare (FISH) Zytogenetik
• Molekular: RT-PCR und RQ-PCR

Zytogenetische Untersuchungen werden zum Zeitpunkt der Diagnose einer akuten Leukämie durchgeführt. Tatsächlich basiert die WHO-Klassifikation der akuten Leukämie aus dem Jahr 2008 weitgehend auf dem Vorhandensein wiederkehrender zytogenetischer und molekularer Anomalien. Die häufigsten Chromosomenaberrationen wurden mit spezifischen klinischen und biologischen Merkmalen in Verbindung gebracht und werden heute als Diagnose- und Prognosemarker verwendet. Diese Chromosomenanomalien betreffen Gene, die am Prozess der Leukämogenese beteiligt sind. Es gibt verschiedene Arten dieser Neuordnungen:

• Fusionsgene verursachen:

  • Unterdrückung der Transkriptionsaktivität von Genen, die an der Differenzierung hämatopoetischer Zellen beteiligt sind (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Deregulierung des Signaltransduktionswegs (z. B. chimäres BCR-ABL-Protein mit konstitutiver Tyrosinkinaseaktivität)
  • Veränderungen im Zustand der Chromatinkondensation, die zu Veränderungen der Transkription führen (MLL-Genumlagerungen in 11q23, MOZ und 8p11…)
• Deregulierung der Genexpression: Chromosomenumlagerungen können manchmal zu einer Deregulierung benachbarter Gene zum Bruchpunkt führen. Beispielsweise induzieren inv(3)(q21q26) oder t(3;3)(q21;q26) eine Überexpression des Transkriptionsfaktors EVI-1.
• Funktionsverlust durch Deletion variabler Größe in Genomregionen, die Gene enthalten, die eine Rolle bei der Differenzierung, Apoptose oder Zellproliferation spielen (z. B. IKZF1, PAX5…)

Zusätzlich zum Karyotyp, der eine globale Sicht auf das Genom ermöglicht; FISH, eine gezielte Technik, wird verwendet, um unsichtbare Anomalien des Karyotyps (kryptische Anomalien) oder den Zeitpunkt des Karyotypversagens hervorzuheben. Konventionelle und molekulare zytogenetische Techniken zeigen jedoch keine Anomalien (z. B. unterschiedliche Partner, die an der Bildung von Fusionsgenen beteiligt sind, insbesondere für die Neuanordnung von MLL-Genen, Mutationen), daher unser Interesse an der Sequenzierung der nächsten Generation. Tatsächlich ist die gezielte Sequenzierung von Boten-RNAs mit hohem Durchsatz ( RNA-seq) hat den Vorteil, dass es die Identifizierung verschiedener Arten von Mutationen in einem einzigen Test ermöglicht, mit Ausnahme epigenetischer Mutationen. Die Bedeutung der RNA-Sequenzierung gegenüber der genomischen DNA liegt einerseits in einer sehr erheblichen Verringerung des Volumens der zu analysierenden Sequenzen, da transkribierte mRNA-Gene etwa 5 % der Genomgröße ausmachen, und andererseits in einer besseren Identifizierung chimärer Gene. Die RNA-Seq wurde als Forschungsinstrument bei hämatologischen Malignitäten eingesetzt. Der Zweck dieses Projekts besteht darin, mithilfe innovativer Technologie ein neues diagnostisches und prognostisches Instrument für hämatologische Malignome zu entwickeln. Es werden 50 akute Leukämien getestet und die Ergebnisse nach drei Kriterien analysiert:

• Quantität, Qualität und Relevanz der bereitgestellten Informationen für Diagnose, Überwachung und Therapiemanagement im Vergleich zu einer herkömmlichen Strategie
• Zeitraum, der benötigt wird, um Ergebnisse zu erhalten, und Methoden zur Verkürzung der Analysezeit, damit Ergebnisse in therapeutische Entscheidungen integriert werden können.
• Wirtschaftliche Bewertung, die die Kosten dieser Diagnoseoption berechnet und das Kosten-Nutzen-Verhältnis bewertet. In Zukunft werden weitere innovative Ansätze implementiert (Untersuchung von Ungleichgewichten genomischer Anomalien durch Array-CGH, ​​Transkriptomanalyse mit Mikroarray und Untersuchung von Methylomen). ), um die „molekulare Signatur“ jeder Leukämie und eine Reihe informativer Anomalien für die Diagnose, Prognose und Behandlung der Krankheit sowie die Überwachung der Resterkrankung zu identifizieren.