Bedeutung des Expressionsniveaus der langen nichtkodierenden RNA CCDC144NL-AS1/Mikro-RNA-143-3p-Achse als neuartige Signatur bei Darmkrebs

1. Einleitung 1.1. Hintergrund Darmkrebs (CRC) ist eine der bösartigsten bösartigen Erkrankungen weltweit und macht fast 8 % aller jährlichen Todesfälle aus [1]. Es gilt als die siebthäufigste Krebsart in Ägypten und macht etwa 3,47 % der Tumoren bei Männern und 3 % der Tumoren bei Frauen aus [2]. Bis 2030 wird es weltweit einen Anstieg der Inzidenz und Mortalität von Darmkrebs um schätzungsweise 60 % geben [3]. CRC im Frühstadium verläuft in der Regel asymptomatisch, wenn sich jedoch Symptome manifestieren, ist eine rechtzeitige Erkennung unerlässlich, da jede Verzögerung der Diagnose die Sterblichkeitsrate erhöhen kann [4].

   1.2. Problem: Eine chirurgische Resektion könnte 90 % der Darmkrebserkrankungen im Frühstadium heilen. Dennoch haben die meisten Patienten häufig eine schlechte Prognose, da sie erst in einem fortgeschrittenen Stadium entdeckt werden [5]. Obwohl die Koloskopie-Gewebebiopsie häufig für die CRC-Diagnose verwendet wird, handelt es sich um einen invasiven Hochrisikotest, der sich nicht gut in routinemäßige medizinische Untersuchungen zur Langzeitüberwachung oder Prognose integrieren lässt und als teilweise repräsentativ für intermetastatische oder tumorale genetische Heterogenität angesehen wird [ 6]. Die klassischen zirkulierenden Tumorbiomarker (TMs) wie das Kohlenhydratantigen 19-9 (CA19-9) und das karzinoembryonale Antigen (CEA) [7] werden trotz ihrer begrenzten Sensitivität und Spezifität als Follow-up- oder Prognosemarker verwendet [8]. Daher besteht ein dringender Bedarf an effizienteren prognostischen molekularen Biomarkern, bei denen es sich um „epi/genetische molekulare Marker“ handeln könnte, die zwei Vorteile haben: erstens potenzielle therapeutische Ziele bergen und zweitens klassische zirkulierende TMs ergänzen um die CRC-Präzision zu verbessern. Die Flüssigbiopsie hat sich als minimalinvasives Diagnoseinstrument zur Analyse tumorgenetischer und epigenetischer molekularer Marker herausgestellt, die in den Kreislauf freigesetzt werden. Die Flüssigbiopsie erfasst die genetische Heterogenität des Tumors besser und spiegelt das dynamische Bild der molekularen Landschaft des Tumors mit kürzerer Verarbeitungszeit und geringeren Kosten als bei der Gewebebiopsie wider [9]. Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) sind RNA-Moleküle mit einer Länge von >200 Nukleotiden, die die Genexpression auf transkriptioneller, posttranskriptioneller und translationaler Ebene regulieren, aber nicht für die Proteinsynthese kodieren können [10-12]. Mehrere Krebsarten weisen Deregulierungen von lncRNAs auf, die an allen Krebsmerkmalen beteiligt sind, einschließlich der Krebsentstehung, -progression und -metastasierung [13,14]. Neue Studien zeigten, dass mehrere lncRNAs an der Entstehung, Metastasierung und Progression von CRC-Tumoren beteiligt sind [15,16]. Über ihr diagnostisches Potenzial hinaus würden lncRNAs auch als mögliche therapeutische Ziele dienen [17]. Coiled-lncRNA-Coil-Domäne mit 144 N-Terminal-ähnlichen Antisense 1 (CCDC144NL-AS1) auf 17p11.2 Das menschliche Chromosom ist eine neuartige onkogene lncRNA, von der kürzlich berichtet wurde, dass sie an der Karzinogenese beteiligt ist [18]. Es wurde festgestellt, dass LncRNA CCDC144NL-AS1 bei verschiedenen Krebsarten hochreguliert ist, darunter Magenkrebs (GC) [18], hepatozelluläres Karzinom (HCC) [19], nichtkleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) [20] und Eierstockkrebs (OC) [ 21], Osteosarkom [22] und CRC [23]. Allerdings muss seine klinische Rolle als Biomarker für CRC noch geklärt werden. MicroRNAs (miRNAs oder miRs) sind einzelsträngige, kleine RNA-Moleküle mit einer Länge von 18–25 Nukleotiden [24]. Sie haben eine regulatorische Funktion bei einer Vielzahl physiologischer Prozesse, darunter Zelldifferenzierung, Wachstum, Apoptose, immunologische Reaktion, Hämatopoese und Proliferation [25]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass miRs neben ihrem Potenzial als molekulare Biomarker und mögliche therapeutische Erfolge sowohl bei der Entstehung als auch beim Fortschreiten von Darmkrebs eine entscheidende Rolle spielen [26-28]. Hsa-miR-143 auf dem menschlichen Chromosom 5q32 [29] ist ein Tumorsuppressor-miR, von dem berichtet wird, dass er durch miR-vermittelte posttranskriptionelle Gen-Stummschaltung bei mehreren menschlichen Krebsarten, einschließlich Prostatakrebs [30] und Gebärmutterhalskrebs [31], herunterreguliert wird ], OC [32] und B-Zell-Lymphom [33]. Der 3'-Arm des miR-Vorläuferprodukts hsa-miR-143-3p ist bei CRC herunterreguliert und ob er zur CRC-Initiierung beitragen würde [34], wird derzeit klinisch untersucht. Die LncRNA-miR-Wechselwirkung spielt bei verschiedenen Krebsentstehungen eine wesentliche Rolle [35,36]. Es wurde berichtet, dass CCDC144NL-AS1 während der GC-Progression als konkurrierende endogene RNA (ceRNA) für hsa-miR-143-3p fungiert, indem es mit den gemeinsamen Bindungsregionen von miRs konkurriert, um diese zu sequestrieren und somit die Expression von miRs stromabwärts zu verändern Zielgene oder Proteine ​​[18]. Von Fan et al. experimentell bestätigt. [37] in GC-lncRNA CCDC144NL-AS1-Hochregulierung in GC-Geweben und Schwämmen von hsa-miR-143-3p, gefolgt von einer hochregulierten Expression seines direkten endogenen Zielproteins. In ähnlicher Weise könnte die bisher nicht abgeschätzte klinische Korrelation zwischen lncRNA CCDC144NL-AS1 und hsa-miR-143-3p in peripheren Blutproben von CRC-Patienten unser Verständnis der molekularen Pathogenese von CRC weiter verdeutlichen und die in dokumentierten Krebsbefunde belegen silico. Das High Mobility Group AT-Hook 2 (HMGA2)-Gen, das von 5 Exons und einem offenen Leserahmen von 330 Basenpaaren kodiert wird, befindet sich im menschlichen Chromosomenband 12q13-15 [38]. Die HMGA2-Proteinkonzentration der erwachsenen normalen Zelle ist unter normalen physiologischen Bedingungen minimal oder fehlt, sie wird jedoch während der Embryogenese [38] und der Karzinogenese [39,40] stark exprimiert. Patienten mit CRC, die eine HMGA2-Überexpression aufweisen, haben eine schlechtere Prognose [41]. HMGA2 ist an fast jedem Stadium der biologischen Aktivität von CRC beteiligt, einschließlich Zellteilung, Proliferation, Apoptose, Seneszenz, Tumorinvasion, epithelial-tomesenchymalem Übergang (EMT), DNA-Reparaturmechanismus und der Fähigkeit der Stammzellen zur Selbsterneuerung [42]. Es wurde berichtet, dass HMGA2 bei Osteosarkomen durch CCDC144NL-AS1 positiv moduliert wird [22].

   1.3. Ziel Die onkogene lncRNA CCDC144NL-AS1 wird in hervorgehoben, wenn sie an der CRC-Pathogenese beteiligt ist, indem sie als ceRNA fungiert/den Tumorsuppressor hsamiR-143-3p schwächt und darüber hinaus die Expression seines endogenen Ziels HMGA2 als Interaktionsarm hochreguliert aktuelle Studie.

   1.4. Ziele Aufklärung der Rolle von lncRNA CCDC144NL-AS1, hsa-miR-143-3p und HMGA2-Protein als nicht-invasive epigenetische molekulare Biomarker bei der Flüssigbiopsie ägyptischer CRC-Patienten, einzeln oder als Interaktionsarm und im Vergleich zum herkömmlichen Protein TMs. Darüber hinaus untersuchten wir die mögliche Rolle der lncRNA CCDC144NL-AS1 als Mediator für die Entwicklung und/oder das Fortschreiten des Krebsphänotyps sowie der CRC-Metastasierung und ihre Beziehung zu hsa-miR-143-3p und HMGA2 klinisch und in silico .

2. Themen 2.1. Stichprobengröße und Aussagekraft der Studie Basierend auf der vorherigen Studie von Zhang et al. im Jahr 2019 war lncRNA CCDC144NL-AS1 normalverteilt mit einer Standardabweichung (3,2) und einer großen Effektgröße (0,85) [43]. Wenn die tatsächlichen Unterschiede zwischen den Mittelwerten der CRC-Gruppe und der Kontrollgruppe 1 bzw. 3,3 betragen, beträgt die Studiengruppengröße 34 Patienten und 34 Kontrollpersonen. Die Gesamtstichprobengröße betrug 68 Fälle, was aufgrund der erwarteten Verluste um 25 % erhöht wurde, und die Gesamtstichprobe umfasste schließlich 90 Probanden, 60 CRC-Probanden und 30 Kontrollpersonen (2:1). Damit soll die Nullhypothese zurückgewiesen werden können, dass die Populationsmittelwerte der Versuchsgruppen mit einer Wahrscheinlichkeit (Potenz) von 0,8 gleich sind. Die mit diesem Test dieser Nullhypothese verbundene Fehlerwahrscheinlichkeit vom Typ I beträgt (0,05). Die Schätzung der Stichprobengröße wurde mit dem Online-Rechner für die Stichprobengröße von G Power* http://www.gpower.hhu.de/en.html durchgeführt. je nach beidseitigem Konfidenzniveau 95 %.

   2.2. Studiendesign Fallkontrollierte retrospektive monozentrische Studie. 2.3. Erklärung des Institutional Review Board (IRB) Die Forschungsethikkommission der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams University erteilte die ethische Genehmigung zur Durchführung der Studie im Jahr 2022. Alle Teilnehmer (Kontrollen oder Patienten) waren sich des Zwecks der Studie voll bewusst und unterzeichneten eine schriftliche, ethisch genehmigte Einverständniserklärung (I⋅C). Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den 2013 genehmigten Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt [44]. 2.4. Studienteilnehmer 2.4.1. Patientengruppe Insgesamt wurden 60 ägyptische Patienten, die keine primäre CRC-Behandlung hatten und im Dar Al Shefa-Krankenhaus in Kairo, Ägypten, aufgenommen wurden, in die Studie aufgenommen.

   2.4.1.1. Einschlusskriterien der Patienten. Patienten, die die Koloskopie-Abteilung zur kolorektalen Untersuchung aufsuchen und an unterschiedlichen Dickdarmsymptomen leiden, einschließlich der CRC-Alarmsymptome, Verstopfung, Bauchschmerzen, rektaler Blutung und plötzlichem Gewichtsverlust. Die CRC-Diagnose wurde klinisch durch Koloskopie, abdominale Röntgenbildgebung und histopathologisch bestätigt.

   2.4.1.2. Ausschlusskriterien der Patienten. Patienten, die an entzündlichen Erkrankungen, hämatologischen Störungen oder einer anderen Krebserkrankung als Darmkrebs leiden, oder Patienten, die eine Chemotherapie oder Bestrahlung erhalten oder sich einer Operation unterzogen haben, Patienten mit hämatologischen Erkrankungen oder einer anderen Krebserkrankung als Darmkrebs. Personen mit unzureichenden Daten oder fehlender histopathologischer Diagnose sowie Personen mit Fernmetastasen zum Zeitpunkt der Diagnose wurden von der Studie ausgeschlossen.

   2.4.2. Kontrollgruppe: 30 scheinbar gesunde Freiwillige mit gleichem Alter und gleichem Geschlecht, die keine Medikamente erhielten oder an einer Krankheit litten, im Alter zwischen 30 und 60 Jahren, wurden als Kontrollen einbezogen, männlich zu weiblich 1:1 (15/15). Kontrollpersonen wurden zufällig im Rahmen routinemäßiger Kontrolluntersuchungen für sich selbst oder während der Blutspende rekrutiert.

   2.4.3. Demografische, klinische und pathologische Daten des Patienten. Demografische Daten des Patienten, einschließlich Alter, Geschlecht, Raucherstatus und vollständige Anamnese des Patienten, abgerufen aus den Krankenakten des Krankenhauses. Zusätzlich zur Anamnese der Patienten nach kolorektalen Operationen wurden die komplette Familienanamnese von Krebserkrankungen sowie die Anamnese von Diabetes mellitus (D.M.) und Bluthochdruck (HTN) erfasst, um den Status/die Auswirkungen nicht übertragbarer Krankheiten zu bestimmen. Aus den Patientenakten wurden die folgenden Chemielaborergebnisse für statistische Korrelationen, CEA, CA19-9 und routinemäßige biochemische Tests der Leberfunktionsprofile von Alaninaminotransaminase (ALT), Aspartataminotransaminase (AST) und Serumalbumin sowie Nierenfunktionstests aufgezeichnet einschließlich Serumkreatinin und Serumharnstoff. Hämoglobin (Hgb) sowie Prothrombinzeit (PT), Thrombozytenzahl, Lymphozytenzahl, Laktatdehydrogenase (LDH) und C-reaktives Protein (CRP) wurden im Labor für klinische Biochemie des Dar Al Shefa Hospital in Kairo im Blut gemessen , Ägypten. Tumorlokalisation, Tumorgröße, Tumortyp, ob schleimig oder nicht, LN-Metastasierung (LNM), Tumorinvasion oder Gefäßinvasion, Tumordifferenzierung, Tumorgrad, Stadieneinteilung der Tumorknotenmetastase (TNM), Entzündungsstatus als entzündliche Darmerkrankung (IBD) Die Lokalisation des Darmkrebses im Dickdarm oder Rektal sowie im Quer-, Sigmoid-, Rektosigmoid- und Rektalbereich wurde aus den Patientenakten der Statistikabteilung des Dar Al Shefa-Krankenhauses in Kairo entnommen.

   Es wurden auch pathologische Aufzeichnungen gemäß den Kriterien des American Joint Committee (AJCC) on Cancer 2010 [45] gesammelt. Die Patienten wurden in drei Stadien von II bis IV eingeteilt: Stadium I/II ist der lokale Krebs ohne LN-Beteiligung (N0), Stadium III mit LN-Beteiligung (N1-x) und Stadium IV mit Fernmetastasierung (M1). Das CRC-Stadieneinteilung wurde anhand der Koloskopieergebnisse, der Abdomenradiographie, der pathologischen Befunde und der klinischen Bewertung bestimmt, wobei das frühe Stadium T2 auf die Invasion des Tumors in die Muscularis propria hinweist, T3 auf das Eindringen des Tumors in die Subserosa und die Muscularis propria und das späte Tumorstadium Stadium T4 zeigt an, dass es in das Rektum oder mehrere Dickdarmschichten eingedrungen ist.

3. Methoden 3.1. In-silico-Datenbank(en)-Suche und -Analyse (abgerufen im Oktober 2021 und überarbeitet im Juli 2023) 3.1.1. Identifizierung der untersuchten ncRNAs durch Bioinformatik Das HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) https://www. genenames.org/ unterstützt durch ein Stipendium des National Human Genome Research Institute, National Center for Biotechnology Information (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, NCBI Genome Data Viewer (GDV) [46] (USA.gov) und Ensembl-Datenbanken https://www.ensembl.org/index.

html für die Charakterisierung menschlicher ncRNA-Gene (Ensembl-Version 109) CCDC144NL-AS1 und MIR-143 sind in Tabelle 1 aufgeführt.

3.1.2. LncRNA-Krankheit v2.0-Expression Die LncRNA- und Krankheitsdatenbank (Version 2.0) [47] http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home zur Untersuchung der lncRNA-CCDC144NL-AS1-Expression in verschiedenen Krebsarten, die aus validierten Experimenten gewonnen wurden Ergebnisse in Veröffentlichungen oder vorhergesagt http://www. rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home/detail/LDA0044869.

3.1.3. Expression von miR, lncRNA oder Genen bei 32 Krebsarten über die Pan-Cancer-Analyseplattform ENCORI [48] https://rnasysu.com/encori/panCancer.php. Die Expressions-Boxplot-Werte von Genen aus RNA-seq-Daten wurden mit log2(FPKM +0,01) skaliert, während diejenigen aus miRNA-seq-Daten mit log2(RPM + 0,01) skaliert wurden.

3.1.4. Assoziation über die miREnvironment-Datenbank [49,50] http://www.cuilab.cn/miren#fragment-1of kuratierte und gesammelte experimentell unterstützte miRNA- und verschiedene Umweltfaktoren (394-Faktor)-Interaktion und die damit verbundenen Phänotypen (28. Juni 2011, die ursprüngliche miREnvironment-Datenbank wurde veröffentlicht, letzte Aktualisierung: 9. September 2012) zur Analyse für has-miR-143 -3p als Vorhersage des Zusammenhangs zwischen Umweltfaktoren und menschlichen Krankheiten.

3.1.5. Interaktion über die lncRNASNP2-human [51] Die lncRNA CCDC144NL-AS1 oder HMGA2 als nicht konservierte Ziele von miRNA:hsa-miR-143 http://www.noncode.org/gene_trans_search.php search_type=keyword&keyword=CCDC144NL-AS1&sbt= Suchen.

3.1.5.1. Die Bindung zielt auf die Interaktion ab. Bindungsziele für hsa-miR-143-3p, vorhergesagt über die Datenbank RNAhybrid 2.2 https://mybiosoftware.com/rna 22-v2-microrna-target-detection.html [52], http://bibiserv.cebitec.uni -bielefeld.de/rnahybrid [53] und RNA22 v2 microRNA-Zielerkennung https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/ vom Jefferson Computational Medicine Center (CMC) [54] zur Vorhersage der hsa-miR-143-3p-Interaktion mit entweder lncRNA CCDC144NL-AS1 oder HMGA2 als Ziel und Datenbank-RNA22-v2-microRNA-Zielerkennung.

3.1.6. Funktionelle Anreicherungsanalyse, gezielte Pfade und Heatmaps 3.1.6.1. KEGG zielte auf Pfade, Cluster/Heatmaps mit DIANA ab. Rückwärtssuche [55] https://dianalab.e-ce.uth.gr/html/universe/index. php?r=mirpath zur Identifizierung von an KEGG-Pfaden beteiligten miRs mithilfe von Mirpath unter Verwendung der DIANA-TarBase v7.0-Heatmap mit Cluster-Dendrogramm mit statistisch signifikanten Ergebnissen in Rot durch eine posteriori-Analysemethode nach Durchführung einer Anreicherungsanalyse, festgelegter p-Wert-Schwellenwert auf 0,05 und der MicroT-Schwellenwert auf 0,8 eingestellt (Zugriff am 25. Juli 2023). Funktionale Anreicherungsanalyse mit STRING Version 11.5 https://string-db.org/ [56]. Schließlich mit dem Genome Browser (UCSC) [57] Erstveröffentlichung Dezember 2013; Patch-Release 14 vom Juni 2022, ausgewählte Top-Gene, Ziele von HMGA2-Interaktionen und Signalwegen aus kuratierten Datenbanken und Textmining https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway (Zugriff am 25. Juli 2023). 3.2. Blutproben Fünf Milliliter peripheres venöses Blut wurden Kontrollpersonen und CRC-Patienten unter streng sterilen Bedingungen und nach internationalen Standard-Sicherheitsverfahren für die Biosicherheit in Polymergel-Gerinnselaktivator-Vakutainern (Greiner Bio-One GmbH, Australien) entnommen. Bei Raumtemperatur (25 °C) wurden vollständig koagulierte Proben 10 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert. Die erhaltenen Seren wurden in drei DNase/RNase-freie Eppendorf-Röhrchen aliquotiert und zur molekularen Analyse bei -80 °C gelagert.

3.2.1. Gesamt-RNA-Extraktion Mit dem miRNeasy Mini-Kit (Kat. Nr.217004; Qiagen, Hilden, Deutschland) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers aus Serumproben eine RNA-Extraktion durchgeführt. Die isolierte RNA wurde in 40 μL RNase-freiem Wasser eluiert.

3.2.2. Quantifizierung gereinigter RNA einschließlich miRNAs Mit einem NanoDrop® 1000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) wurden die Konzentration und Reinheit aller RNA-Proben bestimmt. Zur Messung der Konzentration wurde die Absorption bei 260 nm verwendet. der RNA in der Probe, während zur Bewertung der RNA-Reinheit die Verhältnisse 260/280 und 260/230 nm verwendet wurden. Nach der Quantifizierung wurde die isolierte und eluierte RNA bei gelagert

-80 ◦C in Aliquots. 3.2.3. Reverse Transkription und Messung der ncRNA-Expression 3.2.3.1. cDNA-Synthese und Messung der lncRNA CCDC144NL-AS1-Expression mittels qRT-PCR. Die Gesamt-RNA wurde mit dem Xpert cDNA Synthesis Kit (Kat.-Nr.) revers in cDNA transkribiert. Nr. GK80.0100; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugal) enthält Xpert Reverse Transkriptase (RNase H-), eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die für die cDNA-Synthese aus langen RNA-Vorlagen gemäß dem Protokoll des Herstellers geeignet ist. Die synthetisierte cDNA wurde dann bis zur qRT-PCR bei -20 °C gelagert. Die Expression von lncRNA CCDC144NL-AS1 wurde mit dem Xpert Fast SYBR (Kat. Nr. GE20.0100; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugal) gemäß dem Herstellerprotokoll. Der Primer-RT2-lncRNA-qPCR-Assay für humanes CCDC144NL-AS1 (Hs04941765 m1, Kat. Nr. 4426961) wurde verwendet, um den Grad der Expression der lncRNA CCDC144NL-AS1 zu bestimmen. Der humane GAPDH-Primer (LPH31725A-200, Kat. Nr. 330701) wurde als endogene Kontrolle verwendet, um die Expression von lncRNA CCDC144NLAS1 zu normalisieren.

3.2.3.2. cDNA-Synthese und Messung der hsa-miR-143-3p-Expression mittels qRT-PCR. Für die cDNA-Synthese wurde das miRCURY LNA RT Kit verwendet (Kat. Nr. 339340, Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die resultierende cDNA wurde bis zur Quantifizierung bei -20 °C aufbewahrt. qRT-PCR wurde verwendet, um die Expression von hsamiR-143-3p mit dem miRCURY LNA miRNA PCR Assay (Kat. Nr. 339306, Qiagen, Hilden, Deutschland). Der Primer SNORD38B (hsa) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (YP00203901, Kat. Nr. 339306) wurde als endogene Kontrolle verwendet, um die Expression von hsa-miR-143-3p zu normalisieren. Die Reaktion wurde mit dem PCRmax Eco™48 qRT-PCR-System (PCRmax, Staffordshire, USA) durchgeführt.

Die Primersequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Alle diese Primer wurden von Qiagen entwickelt https://www.qiagen.com/workflow-configurator/ Workflows intcmp=CM_QF_WFC_1121_OTHERS_QB_nav_products, mit Ausnahme von lncRNA CCDC144NL-AS1, das von Thermofisher https://www.thermofisher.com/taqman-gene-expression/pr bezogen wurde oduct/Hs04941765_m1 (Zugriff im Oktober 2021). Die relative RNA-Expression wurde als fache Änderung unter Verwendung der Zyklusschwellenmethode (Ct) (2-ΔΔCt) mit GAPDH oder SNORD38B (hsa) als interne Kontrolle für lncRNA CCDC144NL-AS1 bzw. hsa-miR-143-3p berechnet und normalisiert . ΔCt wurde durch Subtrahieren der Ct-Werte von GAPDH und SNORD38B (hsa) von denen der lncRNA CCDC144NL-AS1 bzw. hsa-miR-143-3p bestimmt; wobei ΔΔCt = ΔCt-Krebsproben – ΔCt-Kontrollproben [58].

3.2.4. Quantifizierung der HMGA2-Proteinkonzentration durch ELISA Die HMGA2-Proteinkonzentration wurde in Serumproben mit im Handel erhältlichen ELISA-Kits von Bioassay Technology Laboratory (Kat.-Nr. E7513Hu, Jiaxing, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Reaktion basiert auf der Vorbeschichtung der ELISA-Platte mit humanem HMGA2-Antikörper und HMGA2, das in hinzugefügten Proben vorhanden ist, bindet an Antikörper, die die Vertiefungen beschichten. Biotinylierter humaner HMGA2-Antikörper wurde hinzugefügt, um HMGA2 in den Proben zu binden. Anschließend wurde ein zweiter Detektorantikörper hinzugefügt, um den biotinylierten HMGA2-Antikörper zu binden. Eine Substratlösung wurde hinzugefügt, die mit dem Enzym-Antikörper-Zielkomplex reagiert und ein messbares Signal erzeugt, das bei 450 nm gemessen wird.

3.2.5. Indizes und Kennzahlen 3.2.5.1. Der Body-Mass-Index (BMI kg/m2) wurde für jeden Teilnehmer über die Website https://www.nhlbi.nih.gov/health in kg/m2 berechnet /educational/lose wt/BMI/bmicalc.htm. Normalgewichtige Personen haben einen BMI von 18,5–24,9 kg/m2, BMI für Übergewicht 25–29,9 kg/m2 und 30 kg/m2 oder mehr bei Fettleibigkeit. 3.2.5.2. Das Verhältnis von Blutplättchen zu Lymphozyten (PLR) wurde berechnet, indem die Blutplättchenzahl des Patienten (x103 Zellen/μl) durch die Lymphozytenzahl (x103 Zellen/μl) dividiert wurde. PLR ist ein Entzündungsindikator und Prädiktor für die Immunantwort, der einen stärkeren Zusammenhang mit der Schwere entzündlicher Erkrankungen hat als das Verhältnis von Neutrophilen zu Lymphozyten (NLR) [59] oder einzelne Zellen allein.

3.3. Statistische Analyse Die Daten wurden gesammelt und in Microsoft Excel 2019 tabellarisch dargestellt. Statistikpaket für Sozialstudiensoftware SPSS 26.0 (IBM, Armonk, NY) (https://www.ibm.com/products/spss-statistics) und GraphPad Prism® Version 8.01 (GraphPad Software, San Diego, USA) (htt ps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/) wurden für Zahlen verwendet, während MedCalc Statistical Software Version 19.2.6 von (MedCalc Software von Ostende, Belgien) (https://www.medcalc.org) wurde für die Analyse der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve verwendet. Die Daten wurden mithilfe des Shapiro-Wilk-Normalitätstests sowohl für Gruppen- als auch für Untergruppendaten auf Normalität getestet. Da die Daten der Patienten nicht normalverteilt waren, wurden die Daten als Median (Interquartilbereich: IQR (25. Perzentil – 75. Perzentil)) ausgedrückt. Mann-Whitney (U) oder Kruskal-Wallis (H) wurden durchgeführt, um jeweils zwei oder mehr unabhängige Gruppen zu vergleichen.

Die ROC-Kurve wurde verwendet, um den besten Cutoff, die besten Sensitivitäten (SNs), Spezifitäten (SPs), negativen Vorhersagewerte (NPVs) und positiven Vorhersagewerte (PPVs) zu finden, wobei die berechnete Fläche unter der Kurve (AUC) im Bereich von 0 bis lag 1. Bei medizinischen Tests werden negative Wahrscheinlichkeitsverhältnisse (LRs) verwendet, um den diagnostischen oder prognostischen Testnutzen zu verstehen. Im Wesentlichen gibt der LR die Wahrscheinlichkeit an, dass ein Patient an einer Erkrankung leidet. Die Wahrscheinlichkeit, dass sie an der Krankheit oder dem Leiden leiden, steigt mit dem Verhältnis. Ein niedriges Verhältnis hingegen deutet darauf hin, dass dies höchstwahrscheinlich nicht der Fall ist. Daher kann ein Arzt diese Verhältnisse verwenden, um eine Krankheit entweder auszuschließen oder auszuschließen. Das Verhältnis, das ausdrückt, wie wahrscheinlich es ist, dass jemand an der Krankheit oder dem Leiden leidet, unterstützt die SNs und SPs, die durch die ROC-Kurve identifiziert werden. Eine alternative Definition des LR ist SN und SP, wobei negatives LR = (100 – SN)/SP. Der Korrelationskoeffizient r nach Spearman wurde verwendet, um die Korrelation zwischen verschiedenen Variablen zu bewerten. Darüber hinaus wurden die Expressionsniveaus der lncRNA CCDC144NL-AS1, des hsamiR-143-3p und des HMGA2-Proteins auf die Spearman-Korrelation r eingestellt und die Verbindung zwischen zwei Variablen – einer kontinuierlichen und einer dichotomen – mithilfe einer Punkt-Biserial-Korrelation bewertet. Das Signifikanzniveau wurde festgelegt, wenn der p-Wert des zweiseitigen statistischen Analysetests <0,05 ist.