Implikacja poziomu ekspresji osi długiego niekodującego RNA CCDC144NL-AS1/Micro RNA-143-3p jako nowego sygnatury w raku jelita grubego

1. Wprowadzenie 1.1. Tło Rak jelita grubego (CRC) to jeden ze złośliwych nowotworów złośliwych na świecie, odpowiadający za prawie 8% wszystkich zgonów rocznie [1]. Uważa się, że jest to siódmy pod względem częstości występowania nowotwór w Egipcie, stanowiący odpowiednio około 3,47% nowotworów u mężczyzn i 3% nowotworów u kobiet [2]. Szacuje się, że do 2030 r. na całym świecie zapadalność i śmiertelność na CRC wzrośnie o 60% [3]. CRC we wczesnym stadium przebiega zwykle bezobjawowo, ale gdy objawy już się pojawią, konieczne jest wczesne wykrycie, ponieważ wszelkie opóźnienia w rozpoznaniu mogą zwiększyć śmiertelność [4].

   1.2. Problem Resekcja chirurgiczna może wyleczyć 90% CRC we wczesnych stadiach. Niemniej jednak u większości chorych rokowanie jest często złe, gdyż są wykrywane w zaawansowanym stadium [5]. Chociaż biopsja tkanki pod kątem kolonoskopii jest powszechnie stosowana w diagnostyce CRC, jest to jednak badanie inwazyjne obarczone wysokim ryzykiem, niewygodne do stosowania w rutynowym badaniu lekarskim w celu monitorowania podłużnego lub prognozowania i uważa się je częściowo za reprezentatywne dla heterogeniczności genetycznej międzyprzerzutowej lub nowotworowej. 6]. Klasyczne biomarkery krążących nowotworów (TM), takie jak antygen węglowodanowy 19-9 (CA19-9) i antygen rakowo-embrionalny (CEA) [7], pomimo ich ograniczonej czułości i swoistości, są stosowane jako markery obserwacji lub prognozowania [8]. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania bardziej skutecznych prognostycznych biomarkerów molekularnych, które mogłyby być „epi/genetycznymi markerami molekularnymi”, które mają 2 korzyści, po pierwsze, zawierają potencjalny cel(-y) terapeutyczny(e), a po drugie, wzmacniają klasyczne krążące TM, aby w celu poprawy precyzji CRC. Biopsja płynna stała się minimalnie inwazyjnym narzędziem diagnostycznym umożliwiającym analizę genetycznych i epigenetycznych markerów molekularnych nowotworów uwalnianych do krążenia. Biopsja płynna lepiej wychwytuje heterogeniczność genetyczną guza, odzwierciedlając dynamiczny obraz krajobrazu molekularnego guza przy krótszym czasie przetwarzania i niższych kosztach niż biopsja tkanki [9]. Długie niekodujące RNA (lncRNA) to cząsteczki RNA o długości >200 nukleotydów, które regulują ekspresję genów na poziomie transkrypcyjnym, potranskrypcyjnym i translacyjnym, ale nie mogą kodować syntezy białek [10-12]. Wiele typów nowotworów wykazuje deregulację lncRNA, które biorą udział we wszystkich cechach charakterystycznych nowotworu, w tym w powstawaniu nowotworu, progresji i przerzutach [13,14]. Pojawiające się badania ujawniły, że kilka lncRNA bierze udział w powstawaniu nowotworu CRC, przerzutach i progresji [15,16]. Poza ich potencjałem diagnostycznym, lncRNA mogłyby również służyć jako potencjalne cele terapeutyczne [17]. Domena cewki zwiniętego lncRNA zawierająca 144 antysensowny antysens podobny do N-końcowego 1 (CCDC144NL-AS1) zlokalizowana na 17p11.2 ludzki chromosom to nowy onkogenny lncRNA, o którym niedawno doniesiono, że bierze udział w karcynogenezie [18]. Stwierdzono, że LncRNA CCDC144NL-AS1 ulega zwiększonej ekspresji w różnych nowotworach, w tym w raku żołądka (GC) [18], raku wątrobowokomórkowym (HCC) [19], niedrobnokomórkowym raku płuc (NSCLC) [20], raku jajnika (OC) [ 21], kostniakomięsak [22] i CRC [23]. Należy jednak wyjaśnić jego rolę kliniczną jako biomarkera CRC. MikroRNA (miRNA lub miR) to jednoniciowe, małe cząsteczki RNA o długości 18–25 nukleotydów [24]. Pełnią funkcję regulacyjną w różnych procesach fizjologicznych, obejmujących różnicowanie komórek, wzrost, apoptozę, odpowiedź immunologiczną, hematopoezę i proliferację [25]. Kilka badań wykazało, że miR odgrywają kluczową rolę zarówno w inicjacji, jak i progresji CRC, poza ich potencjałem jako biomarkerów molekularnych i możliwych efektów terapeutycznych [26-28]. Hsa-miR-143 zlokalizowany na ludzkim chromosomie 5q32 [29] jest supresorem nowotworu miR, o którym donoszono, że podlega obniżonej regulacji poprzez potranskrypcyjne wyciszanie genów za pośrednictwem miR w kilku ludzkich nowotworach, w tym raku prostaty [30], raku szyjki macicy [31 ], OC [32] i chłoniaka z komórek B [33]. Ramię 3' produktu prekursora miR, hsa-miR-143-3p, jest regulowane w dół w CRC i jeśli mogłoby przyczynić się do inicjacji CRC [34], będzie obecnie badane klinicznie. Interakcja LncRNA-miR odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju różnych nowotworów [35,36]. Doniesiono, że CCDC144NL-AS1 działa jako konkurujący endogenny RNA (ceRNA) dla hsa-miR-143-3p podczas progresji GC, poprzez konkurowanie ze wspólnymi regionami wiążącymi miR, w celu ich sekwestracji, a tym samym zmiany ekspresji miR w dół docelowe geny lub białka [18]. Zatwierdzony eksperymentalnie przez Fana i in. [37] w GC lncRNA Regulacja w górę CCDC144NL-AS1 w tkankach GC i gąbczasty hsa-miR-143-3p, po której następuje zwiększona ekspresja jego bezpośredniego endogennego białka docelowego. Podobnie korelacja kliniczna między lncRNA CCDC144NL-AS1 i hsa-miR-143-3p w próbkach krwi obwodowej pacjentów z CRC, która nie została wcześniej oszacowana, może dodatkowo wyjaśnić naszą wiedzę na temat patogenezy molekularnej CRC i udowodnić ustalenia dotyczące nowotworu udokumentowane w pracy krzem. Gen haka AT 2 grupy o wysokiej mobilności (HMGA2), kodowany przez 5 eksonów i otwartą ramkę odczytu o długości 330 par zasad, znajduje się w paśmie ludzkiego chromosomu 12q13-15 [38]. Stężenie białka HMGA2 w prawidłowych komórkach dorosłych jest minimalne lub nie występuje w normalnych warunkach fizjologicznych, ale ulega silnej ekspresji podczas embriogenezy [38] i karcynogenezy [39,40]. Pacjenci z CRC, u których występuje nadekspresja HMGA2, mają gorsze rokowanie [41]. HMGA2 bierze udział w niemal każdym etapie aktywności biologicznej CRC, w tym w podziale komórek, proliferacji, apoptozie, starzeniu się, inwazji nowotworu, przejściu nabłonkowo-tomesenchymalnym (EMT), mechanizmie naprawy DNA i zdolności komórek macierzystych do samoodnawiania [42]. Doniesiono, że HMGA2 w kostniakomięsaku jest dodatnio modulowany przez CCDC144NL-AS1 [22].

   1.3. Cel Onkogenny lncRNA CCDC144NL-AS1, jeśli jest zaangażowany w patogenezę CRC, działając jako ceRNA/gąbkując supresor nowotworu hsamiR-143-3p, a ponadto zwiększając ekspresję jego endogennego docelowego HMGA2 jako ramienia interakcji, zostanie podkreślone w artykule aktualne badanie.

   1.4. Cele Wyjaśnienie roli lncRNA CCDC144NL-AS1, hsa-miR-143-3p i białka HMGA2 jako nieinwazyjnych epigenetycznych biomarkerów molekularnych w płynnej biopsji egipskich pacjentów z CRC, indywidualnie lub jako ramię interakcji i w porównaniu z konwencjonalnym białkiem TM. Ponadto zbadaliśmy potencjalną rolę lncRNA CCDC144NL-AS1 jako mediatora rozwoju i/lub progresji fenotypu raka, a także przerzutów CRC i jego związek zarówno z hsa-miR-143-3p, jak i HMGA2, klinicznie i in silico .

2. Przedmioty 2.1. Wielkość próby i moc badania Na podstawie poprzedniego badania Zhanga i in. w 2019 r. lncRNA CCDC144NL-AS1 miało rozkład normalny z odchyleniem standardowym (3,2) i dużą wielkością efektu (0,85) [43]. Jeśli prawdziwe różnice między grupą CRC a średnimi z grupy kontrolnej wynoszą odpowiednio 1 i 3,3, liczebność grupy badanej wynosi 34 pacjentów i 34 osoby kontrolne. Całkowita wielkość próby wyniosła 68 przypadków, którą zwiększono o 25% ze względu na oczekiwane straty, a całkowita próba ostatecznie wyniosła 90 pacjentów, 60 pacjentów z CRC i 30 osób z grupy kontrolnej (2:1). Ma to na celu odrzucenie hipotezy zerowej, że średnie populacji grup eksperymentalnych są równe z prawdopodobieństwem (potęgą) 0,8. Prawdopodobieństwo błędu typu I związane z tym testem tej hipotezy zerowej wynosi (0,05). Oszacowanie wielkości próby przeprowadzono za pomocą internetowego kalkulatora wielkości próby G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, w zależności od dwustronnego poziomu ufności 95%.

   2.2. Projekt badania Retrospektywne, jednoośrodkowe badanie kontrolowane przypadkami. 2.3. Oświadczenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Komisja ds. Etyki Badań Naukowych Wydziału Farmacji Uniwersytetu Ain Shams udzieliła zgody etycznej na przeprowadzenie badania, 2022. Wszyscy uczestnicy (kontrola lub pacjenci) byli w pełni świadomi celu badania i podpisali pisemny, etycznie zatwierdzony formularz świadomej zgody (I⋅C). Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Wytycznych Helsińskich zatwierdzoną w 2013 roku [44]. 2.4. Uczestnicy badania 2.4.1. Grupa pacjentów Do badania włączono ogółem 60 nieleczonych wcześniej egipskich pacjentów z pierwotnym CRC, przyjętych do szpitala Dar Al Shefa w Kairze w Egipcie.

   2.4.1.1. Kryteria włączenia pacjentów. Pacjenci zgłaszający się do Oddziału Kolonoskopii na badanie jelita grubego, cierpiący na różnorodne objawy ze strony jelita grubego, w tym niepokojące objawy CRC, zaparcia, bóle brzucha, krwawienia z odbytu i nagłą utratę masy ciała. Rozpoznanie CRC potwierdzono klinicznie na podstawie kolonoskopii, radiogramów jamy brzusznej i badania histopatologicznego.

   2.4.1.2. Kryteria wykluczenia pacjentów. Pacjenci cierpiący na choroby zapalne, zaburzenia hematologiczne, nowotwory inne niż CRC, pacjenci otrzymujący chemioterapię, radioterapię lub osoby, które przeszły operację, pacjenci z zaburzeniami hematologicznymi lub jakimkolwiek nowotworem innym niż CRC. Z badania wykluczono osoby posiadające niewystarczające dane lub brak rozpoznania histopatologicznego, a także osoby, u których w momencie rozpoznania występowały odległe przerzuty.

   2.4.2. Grupa kontrolna 30 dobranych pod względem wieku i płci pozornie zdrowych ochotników, nieotrzymujących żadnych leków ani nie cierpiących na żadną chorobę, w wieku 30–60 lat, włączono jako kontrolę, w proporcji mężczyzna do kobiety 1:1 (15/15). Osoby kontrolne rekrutowano losowo podczas rutynowych badań kontrolnych samodzielnie lub podczas oddawania krwi.

   2.4.3. Dane demograficzne, kliniczne i patologiczne pacjentów Dane demograficzne pacjentów, obejmujące wiek, płeć, palenie tytoniu i pełną historię pacjenta, pobrane ze szpitalnej dokumentacji medycznej. Oprócz historii operacji jelita grubego pacjentów, rejestrowano pełną historię nowotworów w rodzinie, a także historię cukrzycy (DM) i nadciśnienia (HTN), aby określić status/wpływ chorób niezakaźnych. Z dokumentacji pacjentów zarejestrowano następujące wyniki laboratoriów chemicznych, w celu korelacji statystycznych, CEA, CA19-9 i rutynowych badań biochemicznych profilowania czynności wątroby pod względem aktywności aminotransaminazy alaninowej (ALT), aminotransaminazy asparaginianowej (AST) i albuminy surowicy, badań czynności nerek w tym kreatynina w surowicy i mocznik w surowicy. Hemoglobinę (Hgb), czas protrombinowy (PT), liczbę płytek krwi, liczbę limfocytów, dehydrogenazę mleczanową (LDH) i białko C-reaktywne (CRP) mierzono we krwi w Laboratorium Biochemii Klinicznej szpitala Dar Al Shefa w Kairze , Egipt. Lokalizacja guza, wielkość guza, rodzaj guza, czy jest śluzowy czy nie, przerzuty do LN (LNM), naciekanie guza lub naciekanie naczyń, różnicowanie guza, stopień guza, stopień zaawansowania guza i przerzutów do węzłów chłonnych (TNM), stan zapalny jako choroba zapalna jelit (IBD) oraz lokalizację CRC, jeśli znajduje się w okrężnicy lub odbytnicy, a także w przypadku poprzecznej, esicy, odbytnicy i odbytnicy, pobrano z dokumentacji pacjentów w Oddziale Statystyki szpitala Dar Al Shefa w Kairze.

   Zebrano także dokumentację patologiczną według kryteriów American Joint Committee (AJCC) on Cancer 2010 [45]. Pacjentów podzielono na trzy stadia zaawansowania od II do IV, stopień I/II to rak miejscowy bez zajęcia LN (N0), stopień III, w którym występuje zajęcie LN (N1-x) i stopień IV z przerzutami odległymi (M1). Stopień zaawansowania CRC określano na podstawie wyników kolonoskopii, zdjęcia rentgenowskiego jamy brzusznej, zmian patologicznych i oceny klinicznej, gdzie wczesne stadium T2 wskazuje na naciekanie mięśnia właściwego przez guz, T3 wskazuje na penetrację guza do tkanki podsurowiczej i mięśnia właściwego, natomiast późne stadium guza stopień T4 wskazuje, że przedostał się do odbytnicy lub kilku warstw okrężnicy.

3. Metody 3.1. Wyszukiwanie i analiza baz danych in silico (dostęp w październiku 2021 r. i poprawiony w lipcu 2023 r.) 3.1.1. Identyfikacja badanych ncRNA przez bioinformatykę Komitet Nomenklatury Genów HUGO (HGNC) https://www. genenames.org/ przy wsparciu grantu Narodowego Instytutu Badań nad Genomem Człowieka, Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, Przeglądarka danych genomu NCBI (GDV) [46] (USA.gov) i bazy danych Ensembl https://www.ensembl.org/index.

html do charakterystyki ludzkich genów ncRNA (Ensembl wydanie 109) CCDC144NL-AS1 i MIR-143 pokazano w Tabeli 1.

3.1.2. Ekspresja choroby LncRNA v2.0 Baza danych LncRNA i chorób (wersja 2.0) [47] http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home w celu zbadania ekspresji lncRNA CCDC144NL-AS1 w różnych typach nowotworów uzyskanych z zatwierdzonych eksperymentów wyniki w publikacjach lub przewidywaniach http://www. https://rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home/detail/LDA0044869.

3.1.3. Ekspresja za pośrednictwem platformy analizy panrakowej ENCORI [48] https://rnasysu.com/encori/panCancer.php miR, lncRNA lub genów w 32 typach nowotworów. Wartości wykresu pudełkowego ekspresji genów z danych o sekwencji RNA skalowano za pomocą log2 (FPKM + 0, 01), podczas gdy te z danych o sekwencji miRNA skalowano za pomocą log2 (RPM + 0, 01).

3.1.4. Stowarzyszenie poprzez bazę danych miREnvironment [49,50] http://www.cuilab.cn/miren#fragment-1of wyselekcjonowano i zebrano wspierane eksperymentalnie wzajemne oddziaływanie miRNA i różnych czynników środowiskowych (czynnik 394) oraz powiązane z nimi fenotypy (28 czerwca 2011 r., wydano oryginalną bazę danych miREnvironment, ostatnia aktualizacja: 9 września 2012 r.) do analizy dla has-miR-143 -3p jako przewidywanie związku między czynnikami środowiskowymi a chorobami człowieka.

3.1.5. Interakcja poprzez lncRNASNP2-człowiek [51] lncRNA CCDC144NL-AS1 lub HMGA2 jako niekonserwatywne cele miRNA:hsa-miR-143 http://www.noncode.org/gene_trans_search.php search_type=keyword&keyword=CCDC144NL-AS1&sbt= Szukaj.

3.1.5.1. Wiązanie celów interakcji. Wiążące cele dla hsa-miR-143-3p przewidywane za pomocą bazy danych RNAhybrid 2.2 https://mybiosoftware.com/rna 22-v2-microrna-target-detection.html [52], http://bibiserv.cebitec.uni -bielefeld.de/rnhybrid [53] i wykrywanie docelowego mikroRNA RNA22 v2 https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/ przez Jefferson Computational Medicine Center (CMC) [54] w celu przewidzenia interakcji hsa-miR-143-3p z lncRNA CCDC144NL-AS1 lub HMGA2 jako cel i wykrywanie docelowego mikroRNA w bazie danych RNA22 v2.

3.1.6. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego, ukierunkowane ścieżki i mapy cieplne 3.1.6.1. Docelowe ścieżki, klastry/mapa cieplna KEGG przy użyciu DIANA. Wyszukiwanie wsteczne [55] https://dianalab.e-ce.uth.gr/html/universe/index. php?r=mirpath do identyfikacji miR zaangażowanych w szlaki KEGG przy użyciu Mirpath, przy użyciu mapy cieplnej DIANA-TarBase v7.0 z dendrogramem klastrów ze statystycznie istotnymi wynikami w kolorze czerwonym metodą analizy a posteriori po przeprowadzeniu analizy wzbogacania, ustawiony próg wartości p na poziomie 0,05 i próg MicroT ustawiony na 0,8 (dostęp: 25 lipca 2023 r.). Analiza wzbogacenia funkcjonalnego przy użyciu STRING wersja 11.5 https://string-db.org/ [56]. Wreszcie, korzystając z przeglądarki Genome Browser (UCSC) [57] Pierwsza wersja z grudnia 2013 r.; Wersja 14 poprawki z czerwca 2022 r., wybrane najważniejsze geny Cele interakcji i szlaków HMGA2 z wybranych baz danych i eksploracji tekstu https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway (Dostęp: 25 lipca 2023 r.). 3.2. Próbki krwi Od kontroli i pacjentów z CRC pobrano pięć mililitrów obwodowej krwi żylnej, w ściśle sterylnych warunkach, zgodnie ze standardowymi międzynarodowymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego, do próżniowych pojemników z aktywatorem skrzepu w żelu polimerowym (Greiner Bio-One GmbH, Australia). W temperaturze pokojowej (25°C) całkowicie skoagulowane próbki wirowano przy 4000 obr/min przez 10 min. Otrzymaną surowicę podzielono na porcje do trzech probówek Eppendorfa wolnych od DNazy/RNazy i przechowywano w temperaturze -80°C do analizy molekularnej.

3.2.1. Ekstrakcja całkowitego RNA Przy użyciu zestawu miRNeasy Mini (nr kat. nr 217004; Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta, z próbek surowicy przeprowadzono ekstrakcję RNA. Wyizolowany RNA eluowano 40 µl wody wolnej od RNazy.

3.2.2. Ocena ilościowa oczyszczonego RNA, w tym miRNA. Za pomocą spektrofotometru NanoDrop® 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) określono stężenie i czystość wszystkich próbek RNA. Do pomiaru stężenia zastosowano absorbancję przy 260 nm. RNA w próbce, podczas gdy do oceny czystości RNA zastosowano stosunki 260/280 i 260/230 nm. Po ocenie ilościowej wyizolowany i wymyty RNA przechowywano w temp

-80 ◦C w porcjach. 3.2.3. Odwrotna transkrypcja i pomiar ekspresji ncRNA 3.2.3.1. Synteza cDNA i pomiar ekspresji lncRNA CCDC144NL-AS1 metodą qRT-PCR. Całkowity RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu Xpert cDNA Synthesis Kit (nr kat. nr GK80.0100; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugalia) zawierający Xpert Reverse Transcriptase (RNase H-), zależną od RNA polimerazę DNA odpowiednią do syntezy cDNA z długich matryc RNA, zgodnie z protokołem producenta. Zsyntetyzowany cDNA przechowywano następnie w temperaturze -20°C do czasu qRT-PCR. Ekspresję lncRNA CCDC144NL-AS1 mierzono za pomocą Xpert Fast SYBR (nr kat. nr GE20.0100; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugalia) zgodnie z protokołem producenta. Starter RT2 lncRNA qPCR Assay for Human CCDC144NL-AS1 (Hs04941765 m1, nr kat. nr 4426961) wykorzystano do oceny poziomu ekspresji lncRNA CCDC144NL-AS1. Ludzki starter GAPDH (LPH31725A-200, nr kat. nr 330701) zastosowano jako kontrolę endogenną w celu normalizacji ekspresji lncRNA CCDC144NLAS1.

3.2.3.2. Synteza cDNA i pomiar ekspresji hsa-miR-143-3p metodą qRT-PCR. Do syntezy cDNA użyto zestawu miRCURY LNA RT Kit (nr kat. nr 339340, Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcją producenta. Powstały cDNA przechowywano w temperaturze -20°C aż do oznaczenia ilościowego. Do pomiaru ekspresji hsamiR-143-3p zastosowano qRT-PCR przy użyciu testu miRNA PCR miRCURY LNA (nr kat. nr 339306, Qiagen, Hilden, Niemcy). Starter SNORD38B (hsa) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (YP00203901, nr kat. nr 339306) zastosowano jako endogenną kontrolę w celu normalizacji ekspresji hsa-miR-143-3p. Reakcję przeprowadzono przy użyciu systemu PCRmax Eco™48 qRT-PCR (PCRmax, Staffordshire, USA).

Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 2. Wszystkie te podkłady zostały zaprojektowane przez firmę Qiagen https://www.qiagen.com/workflow-configurator/ przepływy pracy intcmp=CM_QF_WFC_1121_OTHERS_QB_nav_products, z wyjątkiem lncRNA CCDC144NL-AS1 uzyskanego z firmy Thermofisher https://www.thermofisher.com/taqman-gene-expression/pr oduct/Hs04941765_m1 (dostęp: październik 2021 r.). Względną ekspresję RNA obliczono i znormalizowano jako krotność zmiany, stosując metodę progu cyklu (Ct) (2-ΔΔCt) z GAPDH lub SNORD38B (hsa) jako kontrolą wewnętrzną odpowiednio dla lncRNA CCDC144NL-AS1 i hsa-miR-143-3p . ΔCt określono przez odjęcie wartości Ct GAPDH i SNORD38B (hsa) od wartości Ct, odpowiednio, lncRNA CCDC144NL-AS1 i hsa-miR-143-3p; gdzie ΔΔCt = ΔCt próbki nowotworu – ΔCt próbki kontrolne [58].

3.2.4. Kwantyfikacja stężenia białka HMGA2 metodą ELISA Stężenie białka HMGA2 mierzono w próbkach surowicy za pomocą dostępnych w handlu zestawów ELISA z Laboratorium Technologii Bioassay (nr kat. E7513Hu, Jiaxing, Chiny) zgodnie z instrukcją producenta. Reakcja polega na wstępnym pokryciu płytki ELISA ludzkim przeciwciałem HMGA2, a HMGA2 obecny w dodanych próbkach wiąże się z przeciwciałami pokrywającymi dołki. Dodano biotynylowane ludzkie przeciwciało HMGA2 w celu związania HMGA2 w próbkach. Następnie dodano drugie przeciwciało wykrywające, aby związać biotynylowane przeciwciało HMGA2. Dodano roztwór substratu, który reaguje z kompleksem enzym-przeciwciało-cel, dając mierzalny sygnał mierzony przy 450 nm.

3.2.5. Wskaźniki i wskaźniki 3.2.5.1. Wskaźnik masy ciała (BMI kg/m2) obliczono w kg/m2 dla każdego uczestnika za pomocą strony internetowej https://www.nhlbi.nih.gov/health /edukacyjne/lose wt/BMI/bmicalc.htm. Osoby o normalnej wadze mają BMI w przedziale 18,5–24,9 kg/m2, nadwaga BMI w granicach 25-29,9 kg/m2 i 30 kg/m2 lub więcej w przypadku otyłości. 3.2.5.2. Stosunek płytek krwi do limfocytów (PLR) obliczono dzieląc liczbę płytek krwi pacjenta (x103 komórek/µl) przez liczbę limfocytów (x103 komórek/µl). PLR jest wskaźnikiem stanu zapalnego i czynnikiem predykcyjnym związanym z odpowiedzią immunologiczną, który ma silniejszy związek z ciężkością chorób zapalnych niż stosunek neutrofili do limfocytów (NLR) [59] lub pojedyncze komórki.

3.3. Analiza statystyczna Dane zebrano i zestawiono w formacie Excel w programie Microsoft Excel 2019. Pakiet statystyczny dla oprogramowania do badań społecznych SPSS 26.0 (IBM, Armonk, NY) (https://www.ibm.com/products/spss-statistics) i GraphPad Prism® wersja 8.01 (GraphPad Software, San Diego, USA) (htt ps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/) do obliczeń wykorzystano oprogramowanie MedCalc Statistical Software w wersji 19.2.6 (MedCalc Software firmy Ostenda, Belgia) (https://www.medcalc.org) wykorzystano do analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Dane sprawdzono pod kątem normalności za pomocą testu normalności Shapiro-Wilka dla danych obu grup i podgrup. Ponieważ dane pacjentów nie miały rozkładu normalnego, dane wyrażono jako medianę (przedział międzykwartylowy: IQR (25-75-ty percentyl). Manna-Whitneya (U) lub Kruskala-Wallisa (H) przeprowadzono w celu porównania odpowiednio dowolnych dwóch lub większej liczby niezależnych grup.

Krzywą ROC wykorzystano do znalezienia najlepszego punktu odcięcia, czułości (SN), swoistości (SP), ujemnych wartości predykcyjnych (NPV) i dodatnich wartości predykcyjnych (PPV), przy czym obliczone pole pod krzywą (AUC) mieściło się w zakresie od 0 do 1. W testach medycznych ujemne współczynniki wiarygodności (LR) służą do zrozumienia użyteczności testu diagnostycznego lub prognostycznego. Zasadniczo LR wskazuje prawdopodobieństwo, że pacjent ma stan lub chorobę. Prawdopodobieństwo, że mają daną chorobę lub stan, wzrasta wraz ze stosunkiem. Z drugiej strony niski wskaźnik wskazuje, że najprawdopodobniej tak się nie dzieje. Dlatego lekarz może wykorzystać te współczynniki, aby wykluczyć lub wykluczyć chorobę. Stosunek, który wyraża prawdopodobieństwo wystąpienia danej choroby lub stanu, potwierdza wartości SN i SP określone za pomocą krzywej ROC. Alternatywną definicją LR są SN i SP, gdzie ujemne LR = (100 - SN)/SP. Do oceny korelacji pomiędzy różnymi zmiennymi wykorzystano współczynnik korelacji r Spearmana. Dodatkowo, poziomy ekspresji białka lncRNA CCDC144NL-AS1, hsamiR-143-3p i HMGA2 ustawiono na korelację r Spearmana, a powiązanie między dwiema zmiennymi – jedną ciągłą i jedną dychotomiczną – oceniano przy użyciu korelacji punktowo-dwuseryjnej. Poziom istotności ustalono, jeśli wartość p w dwustronnym teście analizy statystycznej wynosi <0,05.