Implicación del nivel de expresión del eje largo no codificante CCDC144NL-AS1 / Micro RNA-143-3p como firma novedosa en el cáncer colorrectal

1. Introducción 1.1. Fondo El cáncer colorrectal (CCR) es una de las enfermedades malignas en todo el mundo y representa casi el 8% de todas las muertes anuales [1]. Se considera el séptimo cáncer más prevalente en Egipto y representa aproximadamente el 3,47 % de los tumores masculinos y el 3 % de los tumores femeninos, respectivamente [2]. Para 2030, se estima que habrá un aumento del 60 % en la incidencia y la mortalidad por CCR a nivel mundial [3]. El CCR en etapa temprana suele ser asintomático, pero cuando los síntomas se manifiestan, la detección oportuna es esencial porque cualquier retraso en el diagnóstico puede aumentar las tasas de mortalidad [4].

   1.2. Problema La resección quirúrgica podría curar el 90 % de los CCR en las primeras etapas. Sin embargo, la mayoría de los pacientes suelen tener mal pronóstico ya que se detectan en un estadio avanzado [5]. Aunque la biopsia de tejido por colonoscopia se usa comúnmente para el diagnóstico de CCR, es una prueba invasiva de alto riesgo, no es conveniente implementarla en exámenes médicos de rutina para monitoreo longitudinal o pronóstico y se considera parcialmente representativa de la heterogeneidad genética intermetastásica o tumoral. 6]. Los biomarcadores tumorales (MT) circulantes clásicos como el antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9) y el antígeno carcinoembrionario (CEA) [7] se utilizan como marcadores de seguimiento o pronóstico, a pesar de su sensibilidad y especificidad limitadas [8]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de biomarcadores moleculares de pronóstico más eficientes que podrían ser "marcadores moleculares epi/genéticos" que tengan dos beneficios: en primer lugar, albergan objetivos terapéuticos potenciales y, en segundo lugar, aumentan las MT circulantes clásicas, para para mejorar la precisión del CRC. La biopsia líquida se ha convertido en una herramienta de diagnóstico mínimamente invasiva para analizar marcadores moleculares genéticos y epigenéticos tumorales liberados en la circulación. La biopsia líquida captura mejor la heterogeneidad genética del tumor, lo que refleja la imagen dinámica del panorama molecular del tumor con un tiempo de procesamiento más bajo y un costo menor que la biopsia de tejido [9]. Los ARN largos no codificantes (lncRNA) son moléculas de ARN con> 200 nucleótidos de longitud que regulan la expresión genética a nivel transcripcional, postranscripcional y traduccional, pero no pueden codificar la síntesis de proteínas [10-12]. Múltiples tipos de cáncer exhiben desregulaciones de los lncRNA, que están involucrados en todas las características del cáncer, incluida la génesis, la progresión y la metástasis del cáncer [13,14]. Los estudios emergentes revelaron que varios lncRNA están implicados en la tumorigénesis, metástasis y progresión del CCR [15,16]. Más allá de su potencial para el diagnóstico, los lncRNA también servirían como posibles objetivos terapéuticos [17]. Dominio de bobina de ARN lnc en espiral que contiene 144 antisentido tipo N-terminal 1 (CCDC144NL-AS1) ubicado en 17p11.2 cromosoma humano, es un nuevo lncRNA oncogénico que recientemente se informó que está involucrado en la carcinogénesis [18]. Se descubrió que LncRNA CCDC144NL-AS1 estaba regulado positivamente en varios cánceres, incluido el cáncer gástrico (GC) [18], el carcinoma hepatocelular (HCC) [19], el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [20], el cáncer de ovario (OC) [ 21], osteosarcoma [22] y CCR [23]. Sin embargo, es necesario dilucidar su papel clínico como biomarcador del CCR. Los microARN (miARN o miR) son pequeñas moléculas de ARN monocatenarias que tienen entre 18 y 25 nucleótidos de longitud [24]. Tienen una función reguladora en una variedad de procesos fisiológicos, que involucran diferenciación celular, crecimiento, apoptosis, respuesta inmunológica, hematopoyesis y proliferación [25]. Varios estudios han demostrado que los miR tienen un papel crucial tanto en el inicio como en la progresión del CCR, además de su potencial como biomarcadores moleculares y posibles resultados terapéuticos [26-28]. Hsa-miR-143 ubicado en el cromosoma humano 5q32 [29] es un miR supresor de tumores que, según se informa, está regulado negativamente mediante el silenciamiento génico postranscripcional mediado por miR en varios cánceres humanos, incluido el cáncer de próstata [30] y el cáncer de cuello uterino [31]. ], OC [32] y linfoma de células B [33]. El brazo 3' del producto precursor de miR, hsa-miR-143-3p, está regulado negativamente en el CCR y actualmente se estudiará clínicamente si contribuiría al inicio del CCR [34]. La interacción LncRNA-miR juega un papel esencial durante el desarrollo de diversos tipos de cáncer [35,36]. Se informó que CCDC144NL-AS1 actúa como ARN endógeno (ARNce) competitivo para hsa-miR-143-3p durante la progresión de GC, compitiendo con las regiones de unión comunes de los miR, para secuestrarlos y, por lo tanto, alterar la expresión de los miR en sentido descendente. genes o proteínas diana [18]. Siendo aprobado experimentalmente por Fan et al. [37] en la regulación positiva del lncRNA CCDC144NL-AS1 de GC en tejidos de GC y la esponja hsa-miR-143-3p seguida de la expresión regulada positivamente de su proteína diana endógena directa. De manera similar, la correlación clínica entre el lncRNA CCDC144NL-AS1 y hsa-miR-143-3p en muestras de sangre periférica de pacientes con CCR, que no se han estimado previamente, podría aclarar aún más nuestra comprensión de la patogénesis molecular del CCR y probar los hallazgos sobre el cáncer documentados en silico. El gen AT-hook 2 del grupo de alta movilidad (HMGA2), codificado por 5 exones y un marco de lectura abierto de 330 pares de bases, se encuentra en la banda cromosómica humana 12q13-15 [38]. La concentración de proteína HMGA2 de las células adultas normales es mínima o está ausente en condiciones fisiológicas normales, pero se expresa altamente durante la embriogénesis [38] y la carcinogénesis [39,40]. Los pacientes con CCR que tienen sobreexpresión de HMGA2 tienen un peor pronóstico [41]. HMGA2 participa en casi todas las etapas de la actividad biológica del CCR, incluida la división celular, la proliferación, la apoptosis, la senescencia, la invasión tumoral, la transición epitelial-tomesenquimatosa (EMT), el mecanismo de reparación del ADN y la capacidad de autorrenovación de las células madre [42]. Se informó que HMGA2 en el osteosarcoma estaba modulado positivamente por CCDC144NL-AS1 [22].

   1.3. Objetivo El lncRNA oncogénico CCDC144NL-AS1, si está involucrado en la patogénesis del CCR, actuando como un ceRNA/esponjando el supresor de tumores hsamiR-143-3p y, además, regulando positivamente la expresión de su objetivo endógeno HMGA2 como brazo de interacción, se destacará en el estudio actual.

   1.4. Objetivos Dilucidar el papel de las proteínas lncRNA CCDC144NL-AS1, hsa-miR-143-3p y HMGA2 como biomarcadores moleculares epigenéticos no invasivos en biopsias líquidas de pacientes egipcios con CCR, individualmente o como un brazo de interacción y en comparación con la proteína convencional. MT. Además, investigamos el papel potencial del lncRNA CCDC144NL-AS1 como mediador para el desarrollo y/o progresión del fenotipo del cáncer, así como la metástasis del CCR y su relación tanto con hsa-miR-143-3p como con HMGA2, clínicamente e in silico. .

2. Temas 2.1. Tamaño de la muestra y poder del estudio Basado en el estudio previo de Zhang et al. en 2019, el lncRNA CCDC144NL-AS1 se distribuyó normalmente con una desviación estándar (3,2) y un tamaño de efecto grande (0,85) [43]. Si las verdaderas diferencias entre las medias del grupo CCR y el grupo de control son 1 y 3,3, respectivamente, el tamaño del grupo de estudio es de 34 pacientes y 34 sujetos de control. El tamaño total de la muestra fue de 68 casos, que se incrementó en un 25 % para las pérdidas esperadas, y la muestra total fue finalmente de 90 sujetos, 60 sujetos con CCR y 30 controles (2:1). Esto es para poder rechazar la hipótesis nula de que las medias poblacionales de los grupos experimentales son iguales con una probabilidad (potencia) de 0,8. La probabilidad de error Tipo I asociada con esta prueba de esta hipótesis nula es (0,05). La estimación del tamaño de la muestra se realizó mediante la calculadora en línea del tamaño de la muestra de potencia G* http://www.gpower.hhu.de/en.html. dependiendo del nivel de confianza bilateral 95 %.

   2.2. Diseño del estudio Estudio monocéntrico retrospectivo de casos y controles. 2.3. Declaración de la Junta de Revisión Institucional (IRB) El Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams otorgó el permiso ético para realizar el estudio, 2022. Todos los participantes (controles o pacientes) eran plenamente conscientes del propósito del estudio y firmaron un formulario de consentimiento informado (I⋅C) escrito y aprobado éticamente. Este estudio se realizó de acuerdo con las Directrices de la Declaración de Helsinki aprobadas en 2013 [44]. 2.4. Participantes del estudio 2.4.1. Grupo de pacientes Se inscribieron en el estudio un total de 60 pacientes egipcios sin tratamiento previo para el CCR ingresados ​​en el Hospital Dar Al Shefa, El Cairo, Egipto.

   2.4.1.1. Criterios de inclusión de pacientes. Pacientes que acuden a la Unidad de Colonoscopia para examen colorrectal, que padecen síntomas colónicos variables, incluyendo síntomas alarmantes de CCR, estreñimiento, dolor abdominal, sangrado rectal y pérdida repentina de peso. El diagnóstico de CCR se confirmó clínicamente mediante colonoscopia, radiografía abdominal e histopatológicamente.

   2.4.1.2. Criterios de exclusión de pacientes. Pacientes que padecen trastornos inflamatorios, trastornos hematológicos, cualquier cáncer distinto del CCR, o aquellos que reciben quimioterapia, radiación o han sido sometidos a cirugía, pacientes con trastornos hematológicos o cualquier cáncer distinto del CCR. Se excluyeron del estudio aquellos individuos con datos inadecuados o faltantes de diagnóstico histopatológico, así como aquellos con metástasis a distancia en el momento del diagnóstico.

   2.4.2. Grupo de control: 30 voluntarios aparentemente sanos de la misma edad y sexo, que no recibían ningún medicamento ni padecían ninguna enfermedad, con un rango de edad de 30 a 60 años, se incluyeron como controles, de hombre a mujer 1:1 (15/15). Los sujetos de control fueron reclutados al azar durante exámenes de control de rutina para ellos mismos o durante la donación de sangre.

   2.4.3. Datos demográficos, clínicos y patológicos de los pacientes Los datos demográficos de los pacientes, incluidos la edad, el sexo, el tabaquismo y el historial completo del paciente, extraídos de los registros médicos del hospital. Además de los antecedentes de cirugía colorrectal de los pacientes, se registraron los antecedentes familiares completos de cáncer, así como los antecedentes de diabetes mellitus (D.M) e hipertensión (HTA) para determinar el estado/impacto de las enfermedades no transmisibles. De los archivos de los pacientes, se registraron los siguientes resultados de laboratorio de química, para correlaciones estadísticas, CEA, CA19-9 y pruebas bioquímicas de rutina del perfil de función hepática de alanina aminotransaminasa (ALT), aspartato aminotransaminasa (AST) y albúmina sérica, pruebas de función renal. incluyendo creatinina sérica y urea sérica. La hemoglobina (Hgb), así como el tiempo de protrombina (TP), el recuento de plaquetas, el recuento de linfocitos, la lactato deshidrogenasa (LDH) y la proteína C reactiva (PCR) se midieron en sangre en el Laboratorio de Bioquímica Clínica del Hospital Dar Al Shefa de El Cairo. , Egipto. Sitio del tumor, tamaño del tumor, tipo de tumor, si es mucinoso o no, metástasis LN (LNM), invasión tumoral o invasión vascular, diferenciación tumoral, grado del tumor, estadificación tumor-nódulo-metástasis (TNM), estado de inflamación como enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y las ubicaciones del CCR, si es colónico o rectal, así como si es transversal, sigmoideo, rectosigmoideo y rectal, se obtuvieron de los archivos de los pacientes en la Unidad de Estadísticas del Hospital Dar Al Shefa, en El Cairo.

   También se recopilaron registros patológicos según los criterios del American Joint Committee (AJCC) sobre Cáncer 2010 [45]. Los pacientes se clasificaron en tres estadios, del II al IV, el estadio I/II es el cáncer local sin afectación del LN (N0), el estadio III, donde existe afectación del LN (N1-x), y el estadio IV con metástasis a distancia (M1). La estadificación del CCR se determinó mediante los resultados de la colonoscopia, la radiografía abdominal, los hallazgos patológicos y la evaluación clínica, donde el estadio temprano T2 indica invasión de la muscular propia por el tumor, T3 indica la penetración del tumor a la subserosa y la muscular propia, mientras que el tumor tardío el estadio T4 indica que ha penetrado el recto o varias capas del colon.

3. Métodos 3.1. Búsqueda y análisis de bases de datos in silico (consultada en octubre de 2021 y revisada en julio de 2023) 3.1.1. Identificación de los ncRNA investigados mediante bioinformática El Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC) https://www. genenames.org/ apoyado por la subvención del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, NCBI Genome Data Viewer (GDV) [46] (USA.gov) y bases de datos Ensembl https://www.ensembl.org/index.

html para la caracterización de genes de ncRNA humanos (versión Ensembl 109) CCDC144NL-AS1 y MIR-143 se muestran en la Tabla 1.

3.1.2. Expresión de la enfermedad de LncRNA v2.0 The LncRNA and Disease Database (versión 2.0) [47] http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home para explorar la expresión de lncRNA CCDC144NL-AS1 en diferentes tipos de cáncer recuperados de experimentos validados resultados en publicaciones o previstas http://www. rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home/detail/LDA0044869.

3.1.3. Expresión a través de la plataforma de análisis pan-cáncer ENCORI [48] https://rnasysu.com/encori/panCancer.php de miR, lncRNA o genes en 32 tipos de cánceres. Los valores del diagrama de caja de expresión de los genes de los datos de RNA-seq se escalaron con log2 (FPKM +0,01), mientras que los de los datos de miRNA-seq se escalaron con log2 (RPM + 0,01).

3.1.4. Asociación a través de la base de datos miREnvironment [49,50] http://www.cuilab.cn/miren#fragment-1of Se curó y recopiló miARN respaldado experimentalmente y la interacción de varios factores ambientales (394 factores) y sus fenotipos asociados (28 de junio de 2011, se publicó la base de datos miREnvironment original, última actualización: 9 de septiembre de 2012) para el análisis de has-miR-143. -3p como predicción de asociación entre factores ambientales y enfermedades humanas.

3.1.5. Interacción a través del lncRNASNP2-humano [51] El lncRNA CCDC144NL-AS1 o HMGA2 como objetivos no conservados de miRNA:hsa-miR-143 http://www.noncode.org/gene_trans_search.php search_type=keyword&keyword=CCDC144NL-AS1&sbt= Buscar.

3.1.5.1. Interacción de objetivos vinculantes. Objetivos de unión para hsa-miR-143-3p predichos mediante la base de datos RNAhybrid 2.2 https://mybiosoftware.com/rna 22-v2-microrna-objetivo-detección.html [52], http://bibiserv.cebitec.uni -bielefeld.de/rnahybrid [53] y detección de objetivos de microARN RNA22 v2 https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/ por el Jefferson Computational Medicine Center (CMC) [54] para predecir la interacción hsa-miR-143-3p con cualquiera de los lncRNA CCDC144NL-AS1 o HMGA2 como objetivo, y base de datos de detección de objetivos de microARN RNA22 v2.

3.1.6. Análisis de enriquecimiento funcional, rutas específicas y mapas de calor 3.1.6.1. Rutas específicas de KEGG, grupos/mapa de calor utilizando DIANA. Búsqueda inversa [55] https://dianalab.e-ce.uth.gr/html/universe/index. php?r=mirpath para identificar en las rutas KEGG los miR involucrados usando Mirpath, utilizando el mapa de calor DIANA-TarBase v7.0 con dendrograma de conglomerados con resultados estadísticamente significativos en rojo mediante el método de análisis a posteriori después de realizar un análisis de enriquecimiento, umbral de valor p establecido en 0,05 y el umbral de MicroT establecido en 0,8 (consultado el 25 de julio de 2023). Análisis de enriquecimiento funcional utilizando STRING versión 11.5 https://string-db.org/ [56]. Finalmente, utilizando el Genome Browser (UCSC) [57] versión inicial de diciembre de 2013; Versión 14 del parche de junio de 2022, genes principales seleccionados Objetivos de interacciones y vías de HMGA2 de bases de datos seleccionadas y minería de textos https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway (Consultado el 25 de julio de 2023). 3.2. Muestras de sangre Se extrajeron cinco mililitros de sangre venosa periférica de controles y pacientes con CCR, en estrictas condiciones de esterilidad, siguiendo los procedimientos estándar internacionales de bioseguridad, en vacutainers activadores de coágulos de gel polimérico (Greiner Bio-One GmbH, Australia). A temperatura ambiente (25 ◦C), las muestras completamente coaguladas se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min. Los sueros obtenidos se dividieron en alícuotas en tres tubos Eppendorf libres de DNasa/RNasa y se almacenaron a -80 ◦C para análisis molecular.

3.2.1. Extracción de ARN total utilizando el kit miRNeasy Mini (Cat. No 217004; Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante, a partir de muestras de suero se realizó la extracción del ARN. El ARN aislado se eluyó en 40 µL de agua libre de RNasa.

3.2.2. Cuantificación del ARN purificado, incluidos los miARN. Utilizando un espectrofotómetro NanoDrop® 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.), se determinaron la concentración y la pureza de todas las muestras de ARN. Se usó absorbancia a 260 nm para medir la concentración. de ARN en la muestra, mientras que se utilizaron proporciones de 260/280 y 260/230 nm para evaluar la pureza del ARN. Después de la cuantificación, el ARN aislado y eluido se almacenó a

-80 ◦C en alícuotas. 3.2.3. Transcripción inversa y medición de la expresión de ncRNAs 3.2.3.1. Síntesis de ADNc y medición de la expresión de lncRNA CCDC144NL-AS1 mediante qRT-PCR. El ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Xpert (Cat. nº GK80.0100; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugal) que contiene Xpert Reverse Transcriptase (RNase H-), ADN polimerasa dependiente de ARN apropiada para la síntesis de ADNc a partir de plantillas de ARN largas, siguiendo el protocolo del fabricante. Luego, el ADNc sintetizado se almacenó a -20 ◦C hasta qRT-PCR. La expresión del lncRNA CCDC144NL-AS1 se midió utilizando el Xpert Fast SYBR (Cat. nº GE20.0100; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugal) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ensayo de qPCR del cebador RT2 lncRNA para CCDC144NL-AS1 humano (Hs04941765 m1, cat. No. 4426961) se utilizó para evaluar el nivel de expresión del lncRNA CCDC144NL-AS1. El cebador humano GAPDH (LPH31725A-200, cat. No. 330701) se usó como control endógeno para normalizar la expresión del lncRNA CCDC144NLAS1.

3.2.3.2. Síntesis de ADNc y medición de la expresión de hsa-miR-143-3p mediante qRT-PCR. Se utilizó el kit miRCURY LNA RT para la síntesis de ADNc (Cat. No.339340, Qiagen, Hilden, Alemania) según lo propuesto por las instrucciones del fabricante. El ADNc resultante se mantuvo a -20 ◦C hasta su cuantificación. Se utilizó qRT-PCR para medir la expresión de hsamiR-143-3p utilizando el ensayo de PCR de miARN miRCURY LNA (Cat. n° 339306, Qiagen, Hilden, Alemania). El cebador SNORD38B (hsa) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (YP00203901, cat. No. 339306) se usó como control endógeno para normalizar la expresión de hsa-miR-143-3p. La reacción se llevó a cabo utilizando el sistema PCRmax Eco™48 qRT-PCR (PCRmax, Staffordshire, EE. UU.).

Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 2. Todos estos cebadores fueron diseñados por Qiagen https://www.qiagen.com/workflow-configurator/ flujos de trabajo intcmp=CM_QF_WFC_1121_OTHERS_QB_nav_products, excepto lncRNA CCDC144NL-AS1 que se obtuvo de Thermofisher https://www.thermofisher.com/taqman-gene-expression/pr oduct/Hs04941765_m1 (Consultado en octubre de 2021). La expresión relativa del ARN se calculó y normalizó como cambio de veces utilizando el método del umbral del ciclo (Ct) (2- ΔΔCt) con GAPDH o SNORD38B (hsa) como control interno para el lncRNA CCDC144NL-AS1 y hsa-miR-143-3p, respectivamente. . ΔCt se determinó restando los valores de Ct de GAPDH y SNORD38B (hsa) de los del lncRNA CCDC144NL-AS1 y hsa-miR-143-3p, respectivamente; donde ΔΔCt = ΔCt muestras de cáncer - ΔCt muestras de control [58].

3.2.4. Cuantificación de la concentración de proteína HMGA2 mediante ELISA La concentración de proteína HMGA2 se midió en muestras de suero mediante kits ELISA disponibles comercialmente de Bioassay Technology Laboratory (Cat.No. E7513Hu, Jiaxing, China) según las instrucciones del fabricante. La reacción se basa en recubrir previamente la placa ELISA con anticuerpo HMGA2 humano y el HMGA2 presente en las muestras agregadas se une a los anticuerpos que recubren los pocillos. Se añadió anticuerpo HMGA2 humano biotinilado para unir HMGA2 en las muestras. Luego se añadió un segundo anticuerpo detector para unirse al anticuerpo HMGA2 biotinilado. Se añadió una solución de sustrato que reacciona con el complejo enzima-anticuerpo-objetivo para producir una señal mensurable medida a 450 nm.

3.2.5. Índices y ratios 3.2.5.1. El índice de masa corporal (IMC kg/m2) se calculó en kg/m2 para cada participante utilizando el sitio web https://www.nhlbi.nih.gov/health /educacional/perder peso/BMI/bmicalc.htm. Las personas con peso normal tienen un IMC de 18,5 a 24,9. kg/m2, IMC con sobrepeso entre 25 y 29,9 kg/m2 y 30 kg/m2 o más para obesidad. 3.2.5.2. La relación plaquetas-linfocitos (PLR) se calculó dividiendo el recuento de plaquetas del paciente (x103 células/μL) por el recuento de linfocitos (x103 células/μL). PLR es un indicador de inflamación y un predictor relacionado con la respuesta inmune que tiene un vínculo más fuerte con la gravedad de las enfermedades inflamatorias que la relación neutrófilos/linfocitos (NLR) [59] o cualquiera de las células individuales solas.

3.3. Análisis estadístico Los datos se recopilaron y tabularon en Microsoft Excel 2019. Paquete estadístico para el software de estudios sociales SPSS 26.0 (IBM, Armonk, NY) (https://www.ibm.com/products/spss-statistics) y GraphPad Prism® versión 8.01 (GraphPad Software, San Diego, EE. UU.) (htt ps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/) se utilizaron para las cifras, mientras que MedCalc Statistical Software versión 19.2.6 de (MedCalc Software de Ostende, Bélgica) (https://www.medcalc.org) se utilizó para el análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC). Se probó la normalidad de los datos mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para los datos de ambos grupos y subgrupos. Dado que los datos de los pacientes no estaban distribuidos normalmente, los datos se expresaron como mediana (rango intercuartil: IQR (percentil 25-percentil 75). Se realizaron Mann-Whitney (U) o Kruskal-Wallis (H) para comparar dos o más grupos independientes, respectivamente.

Se utilizó la curva ROC para encontrar el mejor punto de corte, sensibilidades (SN), especificidades (SP), valores predictivos negativos (NPV) y valores predictivos positivos (PPV), con un área bajo la curva (AUC) calculada que osciló entre 0 y 1. En las pruebas médicas, los índices de probabilidad negativos (LR) se utilizan para comprender la utilidad de la prueba de diagnóstico o pronóstico. Básicamente, el LR indica la probabilidad de que un paciente tenga una afección o enfermedad. La probabilidad de que padezcan la enfermedad o afección aumenta con la proporción. Por otro lado, una proporción baja indica que lo más probable es que no sea así. Por lo tanto, un médico puede utilizar estas proporciones para diagnosticar o descartar una enfermedad. La relación, que expresa la probabilidad de que alguien tenga la enfermedad o afección, respalda los SN y SP identificados por la curva ROC. Una definición alternativa de LR es SN y SP, donde LR negativo = (100 - SN)/SP. Se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman r para evaluar la correlación entre diversas variables. Además, los niveles de expresión de las proteínas lncRNA CCDC144NL-AS1, hsamiR-143-3p y HMGA2 se establecieron según la correlación de Spearman r, y el vínculo entre dos variables, una continua y otra dicotómica, se evaluó mediante una correlación biserial puntual. El nivel de significancia se estableció si el valor p de la prueba de análisis estadístico de dos colas es <0,05.