Implication du niveau d'expression de l'axe long non codant CCDC144NL-AS1/Micro RNA-143-3p en tant que nouvelle signature dans le cancer colorectal

1. Introduction 1.1. Contexte Le cancer colorectal (CCR) est l'une des tumeurs malignes malveillantes dans le monde, représentant près de 8 % de tous les décès annuels [1]. Il est considéré comme le 7ème cancer le plus répandu en Égypte, représentant respectivement environ 3,47 % des tumeurs masculines et 3 % des tumeurs féminines [2]. D’ici 2030, on estime qu’il y aura une augmentation de 60 % de l’incidence et de la mortalité du CCR dans le monde [3]. Le CCR à un stade précoce est généralement asymptomatique, mais lorsque les symptômes se manifestent, une détection rapide est essentielle car tout retard dans le diagnostic peut augmenter les taux de mortalité [4].

   1.2. Problème La résection chirurgicale pourrait guérir 90 % des CCR à un stade précoce. Néanmoins, la majorité des patients ont souvent un mauvais pronostic car ils sont détectés à un stade avancé [5]. Bien que la biopsie tissulaire par coloscopie soit couramment utilisée pour le diagnostic du CCR, il s'agit d'un test invasif à haut risque, peu pratique à mettre en œuvre lors d'un examen médical de routine pour une surveillance longitudinale ou un pronostic et est considéré comme partiellement représentatif de l'hétérogénéité génétique inter-métastatique ou tumorale. 6]. Les biomarqueurs tumoraux (TM) circulants classiques comme l'antigène glucidique 19-9 (CA19-9) et l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) [7] sont utilisés comme marqueurs de suivi ou de pronostic, malgré leur sensibilité et spécificité limitées [8]. Par conséquent, il existe un besoin urgent de biomarqueurs moléculaires pronostiques plus efficaces, qui pourraient être des « marqueurs moléculaires épi/génétiques » présentant deux avantages : premièrement, héberger des cibles thérapeutiques potentielles et, deuxièmement, augmenter les MT circulantes classiques, afin pour améliorer la précision du CRC. La biopsie liquide est apparue comme un outil de diagnostic mini-invasif pour analyser les marqueurs moléculaires génétiques et épigénétiques tumoraux libérés dans la circulation. La biopsie liquide capture mieux l’hétérogénéité génétique de la tumeur, reflétant l’image dynamique du paysage moléculaire tumoral avec un temps de traitement plus court et un coût inférieur à celui de la biopsie tissulaire [9]. Les ARN longs non codants (ARNlnc) sont des molécules d'ARN d'une longueur supérieure à 200 nucléotides, qui régulent l'expression des gènes aux niveaux transcriptionnel, post-transcriptionnel et traductionnel, mais ne peuvent pas coder pour la synthèse des protéines [10-12]. Plusieurs types de cancer présentent des dérégulations des ARNlnc, qui sont impliqués dans toutes les caractéristiques du cancer, y compris la genèse, la progression et les métastases du cancer (13,14). Des études émergentes ont révélé que plusieurs ARNnc sont impliqués dans la tumorigenèse, les métastases et la progression du CCR (15,16). Au-delà de leur potentiel diagnostique, les lncRNA serviraient également de cibles thérapeutiques possibles [17]. Domaine de bobine d'ARNnc enroulé contenant 144 antisens 1 de type N-Terminal-Like (CCDC144NL-AS1) situé sur le 17p11.2 chromosome humain, est un nouvel ARNnc oncogène récemment impliqué dans la carcinogenèse (18). LncRNA CCDC144NL-AS1 s'est avéré régulé positivement dans divers cancers, notamment le cancer gastrique (GC) [18], le carcinome hépatocellulaire (CHC) [19], le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) [20] et le cancer de l'ovaire (OC) [ 21], ostéosarcome [22] et CCR [23]. Cependant, son rôle clinique en tant que biomarqueur du CCR doit être élucidé. Les microARN (miARN ou miR) sont de petites molécules d’ARN simple brin d’une longueur de 18 à 25 nucléotides [24]. Ils ont une fonction régulatrice dans divers processus physiologiques, impliquant la différenciation cellulaire, la croissance, l'apoptose, la réponse immunologique, l'hématopoïèse et la prolifération [25]. Plusieurs études ont montré que les miR jouent un rôle crucial à la fois dans l'initiation et la progression du CCR, outre leur potentiel en tant que biomarqueurs moléculaires et succès thérapeutiques possibles (26-28). Hsa-miR-143 situé sur le chromosome humain 5q32 [29] est un miR suppresseur de tumeur qui serait régulé négativement via l'inactivation du gène post-transcriptionnel médié par miR dans plusieurs cancers humains, notamment le cancer de la prostate [30] et le cancer du col de l'utérus [31 ], OC [32] et lymphome à cellules B [33]. Le bras 3' du produit précurseur miR, hsa-miR-143-3p, est régulé négativement dans le CRC et sa contribution à l'initiation du CRC [34] sera actuellement étudiée cliniquement. L'interaction LncRNA-miR joue un rôle essentiel lors du développement de divers cancers (35,36). CCDC144NL-AS1 agirait comme ARN endogène concurrent (ARNce) pour hsa-miR-143-3p au cours de la progression de la GC, en rivalisant avec les régions de liaison communes des miR, afin de les séquestrer et donc de modifier l'expression des miR en aval. gènes ou protéines cibles [18]. Étant approuvé expérimentalement par Fan et al. [37] dans la régulation positive de GC lncRNA CCDC144NL-AS1 dans les tissus GC et l'épongage de hsa-miR-143-3p, suivie d'une expression régulée positivement de sa protéine cible endogène directe. De même, la corrélation clinique entre lncRNA CCDC144NL-AS1 et hsa-miR-143-3p dans les échantillons de sang périphérique des patients atteints de CCR, qui n'a pas été estimée auparavant, pourrait clarifier davantage notre compréhension de la pathogenèse moléculaire du CCR et prouver les résultats du cancer documentés dans silico. Le gène AT-hook 2 (HMGA2) du groupe à haute mobilité, codé par 5 exons et un cadre de lecture ouvert de 330 paires de bases, se trouve dans la bande chromosomique humaine 12q13-15 (38). La concentration en protéine HMGA2 de la cellule adulte normale est minime ou absente dans des conditions physiologiques normales, mais elle est fortement exprimée au cours de l'embryogenèse [38] et de la carcinogenèse [39,40]. Les patients atteints de CCR qui présentent une surexpression de HMGA2 ont un pronostic plus sombre (41). HMGA2 participe à presque toutes les étapes de l'activité biologique du CCR, y compris la division cellulaire, la prolifération, l'apoptose, la sénescence, l'invasion tumorale, la transition épithéliale-tomésenchymateuse (EMT), le mécanisme de réparation de l'ADN et la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches (42). HMGA2 dans l’ostéosarcome aurait été modulé positivement par CCDC144NL-AS1 [22].

   1.3. Objectif L'ARNnc oncogène CCDC144NL-AS1, s'il est impliqué dans la pathogenèse du CCR, en agissant comme un ARNce/épongeant le suppresseur de tumeur hsamiR-143-3p, et en régulant positivement l'expression de sa cible endogène HMGA2 en tant que bras d'interaction, sera mis en évidence dans le étude actuelle.

   1.4. Objectifs Élucider le rôle des protéines lncRNA CCDC144NL-AS1, hsa-miR-143-3p et HMGA2 en tant que biomarqueurs moléculaires épigénétiques non invasifs dans la biopsie liquide de patients égyptiens atteints de CCR, individuellement ou en tant que bras d'interaction et en comparaison avec la protéine conventionnelle MT. De plus, nous avons étudié le rôle potentiel de l'ARNnc CCDC144NL-AS1 en tant que médiateur du développement et/ou de la progression du phénotype du cancer ainsi que des métastases du CCR et sa relation avec hsa-miR-143-3p et HMGA2, cliniquement et in silico. .

2. Sujets 2.1. Taille de l'échantillon et puissance de l'étude Sur la base de l'étude précédente de Zhang et al. en 2019, lncRNA CCDC144NL-AS1 était normalement distribué avec un écart type (3,2) et une grande taille d'effet (0,85) [43]. Si les vraies différences entre les moyennes du groupe CRC et du groupe témoin sont respectivement de 1 et 3,3, la taille des groupes d'étude est de 34 patients et 34 sujets témoins. La taille totale de l'échantillon était de 68 cas, qui a été augmentée de 25 % pour les pertes attendues, et l'échantillon total était finalement de 90 sujets, 60 sujets CRC et 30 témoins (2 : 1). Il s'agit de pouvoir rejeter l'hypothèse nulle, selon laquelle les moyennes de population des groupes expérimentaux sont égales avec une probabilité (puissance) de 0,8. La probabilité d'erreur de type I associée à ce test de cette hypothèse nulle est de (0,05). L'estimation de la taille de l'échantillon a été réalisée à l'aide du calculateur en ligne de la taille de l'échantillon G power* http://www.gpower.hhu.de/en.html, en fonction d'un niveau de confiance bilatéral de 95 %.

   2.2. Conception de l'étude Étude monocentrique rétrospective contrôlée par cas. 2.3. Déclaration de l'Institutional Review Board (IRB) Le comité d'éthique de la recherche de la Faculté de pharmacie de l'Université Ain Shams a accordé l'autorisation éthique de mener l'étude, 2022. Tous les participants (témoins ou patients) étaient pleinement conscients du but de l’étude et ont signé un formulaire de consentement éclairé (I⋅C) écrit, approuvé sur le plan éthique. Cette étude a été menée conformément aux lignes directrices de la Déclaration d'Helsinki approuvées en 2013 [44]. 2.4. Participants à l'étude 2.4.1. Groupe de patients Au total, 60 patients égyptiens naïfs de traitement primaire du CCR admis à l'hôpital Dar Al Shefa, au Caire, en Égypte, ont été inscrits à l'étude.

   2.4.1.1. Critères d'inclusion des patients. Patients visitant l'unité de coloscopie pour un examen colorectal, souffrant de symptômes coliques variables, notamment des symptômes alarmants du CCR, de la constipation, des douleurs abdominales, des saignements rectaux et une perte de poids soudaine. Le diagnostic de CCR a été confirmé cliniquement par coloscopie, radio-imagerie abdominale et histopathologique.

   2.4.1.2. Critères d'exclusion des patients. Patients souffrant de troubles inflammatoires, de troubles hématologiques, de tout cancer autre que le CCR, ou ceux recevant une chimiothérapie, une radiothérapie ou ayant subi une intervention chirurgicale, patients présentant des troubles hématologiques ou de tout cancer autre que le CCR. Les personnes disposant de données insuffisantes ou d'un diagnostic histopathologique manquant, ainsi que celles présentant des métastases à distance au moment du diagnostic ont été exclues de l'étude.

   2.4.2. Groupe témoin composé de 30 volontaires apparemment en bonne santé du même âge et du même sexe, ne recevant aucun médicament ou souffrant d'une quelconque maladie, âgés de 30 à 60 ans, ont été inclus comme témoins, homme-femme 1:1 (15/15). Les sujets témoins ont été recrutés au hasard lors d'examens de contrôle de routine ou lors d'un don de sang.

   2.4.3. Données démographiques, cliniques et pathologiques des patients Les données démographiques des patients, notamment l'âge, le sexe, le statut tabagique et l'historique complet du patient, extraites des dossiers médicaux de l'hôpital. En plus des antécédents de chirurgie colorectale des patients, les antécédents familiaux complets de cancer, ainsi que les antécédents de diabète sucré (DM) et d'hypertension (HTN) ont été enregistrés pour déterminer le statut/l'impact des maladies non transmissibles. À partir des dossiers des patients, les résultats de laboratoire de chimie suivants ont été enregistrés, pour les corrélations statistiques, le CEA, le CA19-9 et les tests biochimiques de routine du profilage de la fonction hépatique de l'alanine aminotransaminase (ALT), de l'aspartate aminotransaminase (AST) et de l'albumine sérique, des tests de la fonction rénale. y compris la créatinine sérique et l'urée sérique. L'hémoglobine (Hgb) ainsi que le temps de prothrombine (PT), la numération plaquettaire, la numération des lymphocytes, la lactate déshydrogénase (LDH) et la protéine C-réactive (CRP) ont tous été mesurés dans le sang au laboratoire de biochimie clinique de l'hôpital Dar Al Shefa, au Caire. , Egypte. Site tumoral, taille de la tumeur, type de tumeur si mucineuse ou non, métastases LN (LNM), invasion tumorale ou invasion vasculaire, différenciation tumorale, grade de la tumeur, stade des métastases ganglionnaires tumorales (TNM), état de l'inflammation en tant que maladie inflammatoire de l'intestin (MII) et les emplacements du CCR s'ils sont côlonaux ou rectaux, ainsi que s'ils sont transversaux, sigmoïdes, rectosigmoïdes et rectaux, ont été collectés à partir des dossiers des patients de l'unité de statistiques de l'hôpital Dar Al Shefa, au Caire.

   Des dossiers pathologiques selon les critères de l'American Joint Committee (AJCC) on Cancer 2010 [45] ont également été collectés. Les patients ont été classés en trois stades de II à IV, le stade I/II est le cancer local sans atteinte du LN (N0), le stade III avec l'implication du LN (N1-x) et le stade IV avec métastases à distance (M1). Le stade du CCR a été déterminé par les résultats de la coloscopie, la radiographie abdominale, les résultats pathologiques et l'évaluation clinique, où le stade précoce T2 indique une invasion de la musculeuse propria par la tumeur, T3 indique la pénétration de la tumeur dans la sous-séreuse et la musculeuse propria, tandis que la tumeur tardive le stade T4 indique qu'il a pénétré le rectum ou plusieurs couches du côlon.

3. Méthodes 3.1. Recherche et analyse de bases de données in silico (consultées en octobre 2021 et révisées en juillet 2023) 3.1.1. Identification des ARNnc étudiés par bioinformatique Le Comité de nomenclature des gènes HUGO (HGNC) https://www. nomsdegenes.org/ soutenu par la subvention du National Human Genome Research Institute, National Center for Biotechnology Information (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, NCBI Genome Data Viewer (GDV) [46] (USA.gov) et bases de données Ensembl https://www.ensembl.org/index.

html pour la caractérisation des gènes des ARNnc humains (Ensembl release 109) CCDC144NL-AS1 et MIR-143 sont présentés dans le tableau 1.

3.1.2. Expression de la maladie LncRNA v2.0 La base de données LncRNA and Disease (version 2.0) [47] http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home pour explorer l'expression de lncRNA CCDC144NL-AS1 dans différents types de cancer extraits de données expérimentales validées résultats dans des publications ou prévus http://www. rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home/detail/LDA0044869.

3.1.3. Expression via la plateforme d'analyse pan-cancer ENCORI [48] https://rnasysu.com/encori/panCancer.php de miR, lncRNA ou de gènes dans 32 types de cancers. Les valeurs de boîte à moustaches d'expression des gènes provenant des données ARN-seq ont été mises à l'échelle avec log2 (FPKM +0,01), tandis que celles des données miARN-seq ont été mises à l'échelle avec log2 (RPM + 0,01).

3.1.4. Association via la base de données miREnvironment [49,50] http://www.cuilab.cn/miren#fragment-1of les interactions entre les miARN et divers facteurs environnementaux (facteur 394) ont été organisées et collectées expérimentalement et leurs phénotypes associés (28 juin 2011, la base de données miREnvironment originale a été publiée, dernière mise à jour : 9 septembre 2012) pour l'analyse du has-miR-143 -3p comme prédiction de l'association entre les facteurs environnementaux et la maladie humaine.

3.1.5. Interaction via le lncRNASNP2-human [51] Le lncRNA CCDC144NL-AS1 ou HMGA2 comme cibles non conservées du miARN : hsa-miR-143 http://www.noncode.org/gene_trans_search.php search_type=keyword&keyword=CCDC144NL-AS1&sbt= Recherche.

3.1.5.1. La liaison cible l’interaction. Cibles de liaison pour hsa-miR-143-3p prédites via la base de données RNAhybrid 2.2 https://mybiosoftware.com/rna 22-v2-microrna-target-detection.html [52], http://bibiserv.cebitec.uni -bielefeld.de/rnahybrid [53] et détection de cibles de microARN ARN22 v2 https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/ par Jefferson Computational Medicine Center (CMC) [54] pour prédire l'interaction hsa-miR-143-3p avec l'un ou l'autre lncRNA CCDC144NL-AS1 ou HMGA2 comme cible et détection de cible de microARN RNA22 v2 dans la base de données.

3.1.6. Analyse d'enrichissement fonctionnel, voies ciblées et cartes thermiques 3.1.6.1. Voies ciblées KEGG, clusters/carte thermique utilisant DIANA. Recherche inversée [55] https://dianalab.e-ce.uth.gr/html/universe/index. php?r=mirpath pour identifier les miR impliqués dans les voies KEGG à l'aide de Mirpath, en utilisant la carte thermique DIANA-TarBase v7.0 avec dendrogramme de cluster avec des résultats statistiquement significatifs en rouge par méthode d'analyse a posteriori après avoir effectué une analyse d'enrichissement, seuil de valeur p défini à 0,05 et seuil MicroT fixé à 0,8 (consulté le 25 juillet 2023). Analyse d'enrichissement fonctionnel à l'aide de STRING version 11.5 https://string-db.org/ [56]. Enfin, en utilisant le Genome Browser (UCSC) [57] version initiale de décembre 2013 ; Patch release 14 de juin 2022, principaux gènes sélectionnés Cibles des interactions et voies HMGA2 à partir de bases de données organisées et d'exploration de textes https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway (Consulté le 25 juillet 2023). 3.2. Échantillons de sang Cinq millilitres de sang veineux périphérique ont été prélevés sur des témoins et des patients atteints de CCR, dans des conditions stériles strictes, conformément aux procédures internationales standard de sécurité en matière de biosécurité, dans des vacutainers activateurs de caillots en gel polymère (Greiner Bio-One GmbH, Australie). À température ambiante (25 °C), les échantillons complètement coagulés ont été centrifugés à 4 000 tr/min pendant 10 min. Les sérums obtenus ont été aliquotés dans trois tubes Eppendorf sans DNase/RNase et stockés à -80 ◦C pour une analyse moléculaire.

3.2.1. Extraction d'ARN total À l'aide du kit miRNeasy Mini (Cat. n°217004 ; Qiagen, Hilden, Allemagne) selon le protocole du fabricant, à partir d'échantillons de sérum, une extraction d'ARN a été réalisée. L'ARN isolé a été élué dans 40 µL d'eau sans RNase.

3.2.2. Quantification de l'ARN purifié, y compris des miARN À l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop® 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), la concentration et la pureté de tous les échantillons d'ARN ont été déterminées. L'absorbance à 260 nm a été utilisée pour mesurer la concentration. d'ARN dans l'échantillon, alors que des ratios de 260/280 et 260/230 nm ont été utilisés pour évaluer la pureté de l'ARN. Après quantification, l'ARN isolé et élué a été stocké à

-80 ◦C en aliquotes. 3.2.3. Transcription inverse et mesure de l'expression des ARNnc 3.2.3.1. Synthèse d'ADNc et mesure de l'expression de lncRNA CCDC144NL-AS1 par qRT-PCR. L'ARN total a été transcrit de manière inverse en ADNc à l'aide du kit de synthèse d'ADNc Xpert (Cat. N° GK80.0100 ; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugal) contenant la Xpert Reverse Transcriptase (RNase H-), une ADN polymérase dépendante de l'ARN adaptée à la synthèse d'ADNc à partir de modèles d'ARN longs, en suivant le protocole du fabricant. L'ADNc synthétisé a ensuite été stocké à -20 ◦C jusqu'à qRT-PCR. L’expression de lncRNA CCDC144NL-AS1 a été mesurée à l’aide du Xpert Fast SYBR (Cat. N° GE20.0100 ; Grisp Research Solutions, Rua Alfredo Allen, Portugal) conformément au protocole du fabricant. Le test RT2 lncRNA qPCR Assay pour le CCDC144NL-AS1 humain (Hs04941765 m1, Cat. No. 4426961) a été utilisé pour évaluer le niveau d’expression du lncRNA CCDC144NL-AS1. L'amorce GAPDH humaine (LPH31725A-200, Cat. No. 330701) a été utilisé comme contrôle endogène pour normaliser l’expression de lncRNA CCDC144NLAS1.

3.2.3.2. Synthèse d'ADNc et mesure de l'expression de hsa-miR-143-3p par qRT-PCR. Le kit miRCURY LNA RT a été utilisé pour la synthèse de l'ADNc (Cat. No.339340, Qiagen, Hilden, Allemagne) comme proposé par les instructions du fabricant. L'ADNc résultant a été conservé à -20 ◦C jusqu'à la quantification. La qRT-PCR a été utilisée pour mesurer l’expression du hsamiR-143-3p à l’aide du test miRCURY LNA miRNA PCR Assay (Cat. No. 339306, Qiagen, Hilden, Allemagne). L’amorce SNORD38B (hsa) miRCURY LNA miRNA PCR Assay (YP00203901, Cat. No. 339306) a été utilisé comme contrôle endogène pour normaliser l'expression de hsa-miR-143-3p. La réaction a été réalisée en utilisant le système PCRmax Eco™48 qRT-PCR (PCRmax, Staffordshire, USA).

Les séquences d’amorces sont répertoriées dans le tableau 2. Toutes ces amorces ont été conçues par Qiagen https://www.qiagen.com/workflow-configurator/ workflows intcmp=CM_QF_WFC_1121_OTHERS_QB_nav_products, à l'exception du lncRNA CCDC144NL-AS1 obtenu auprès de Thermofisher https://www.thermofisher.com/taqman-gene-expression/pr oduct/Hs04941765_m1 (consulté en octobre 2021). L'expression relative de l'ARN a été calculée et normalisée sous forme de changement de pli en utilisant la méthode du seuil de cycle (Ct) (2-ΔΔCt) avec GAPDH ou SNORD38B (hsa) comme contrôle interne pour lncRNA CCDC144NL-AS1 et hsa-miR-143-3p, respectivement. . ΔCt a été déterminé en soustrayant les valeurs Ct de GAPDH et SNORD38B (hsa) de celles des lncRNA CCDC144NL-AS1 et hsa-miR-143-3p, respectivement ; où ΔΔCt = ΔCt échantillons de cancer - ΔCt échantillons de contrôle [58].

3.2.4. Quantification de la concentration en protéine HMGA2 par ELISA La concentration en protéine HMGA2 a été mesurée dans des échantillons de sérum à l'aide de kits ELISA disponibles dans le commerce auprès du Bioassay Technology Laboratory (Cat.No. E7513Hu, Jiaxing, Chine) selon les instructions du fabricant. La réaction est basée sur le pré-revêtement de la plaque ELISA avec l'anticorps HMGA2 humain et le HMGA2 présent dans les échantillons ajoutés se lie aux anticorps recouvrant les puits. Un anticorps HMGA2 humain biotinylé a été ajouté pour lier HMGA2 dans les échantillons. Un deuxième anticorps détecteur a ensuite été ajouté pour se lier à l’anticorps HMGA2 biotinylé. Une solution de substrat a été ajoutée qui réagit avec le complexe enzyme-anticorps-cible pour produire un signal mesurable mesuré à 450 nm.

3.2.5. Indices et ratios 3.2.5.1. L'indice de masse corporelle (IMC kg/m2) a été calculé en kg/m2 pour chaque participant à l'aide du site https://www.nhlbi.nih.gov/health /éducatif/perdre du poids/BMI/bmicalc.htm. Les individus de poids normal ont un IMC compris entre 18,5 et 24,9. kg/m2, surpoids IMC entre 25 et 29,9 kg/m2 et 30 kg/m2 ou plus pour l'obésité. 3.2.5.2. Le rapport plaquettes/lymphocytes (PLR) a été calculé en divisant le nombre de plaquettes du patient (x103 cellules/μL) par le nombre de lymphocytes (x103 cellules/μL). Le PLR ​​est un indicateur d’inflammation et un prédicteur de la réponse immunitaire qui a un lien plus fort avec la gravité des maladies inflammatoires que le rapport neutrophiles/lymphocytes (NLR) [59] ou que les cellules individuelles seules.

3.3. Analyse statistique Les données ont été collectées et compilées sous Excel dans Microsoft Excel 2019. Progiciel statistique pour le logiciel d'études sociales SPSS 26.0 (IBM, Armonk, NY) (https://www.ibm.com/products/spss-statistics) et GraphPad Prism® version 8.01 (GraphPad Software, San Diego, USA) (htt ps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/) ont été utilisés pour les chiffres, tandis que la version 19.2.6 du logiciel statistique MedCalc (logiciel MedCalc d'Ostende, Belgique) (https://www.medcalc.org) a été utilisé pour l’analyse de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC). La normalité des données a été testée à l'aide du test de normalité de Shapiro-Wilk pour les données des groupes et des sous-groupes. Étant donné que les données des patients n'étaient pas distribuées normalement, les données ont été exprimées sous forme médiane (intervalle interquartile : IQR (25e centile-75e centile). Mann-Whitney (U) ou Kruskal-Wallis (H) ont été menés pour comparer respectivement deux ou plusieurs groupes indépendants.

La courbe ROC a été utilisée pour trouver les meilleurs seuils, sensibilités (SN), spécificités (SP), valeurs prédictives négatives (VPN) et valeurs prédictives positives (VPP), avec une aire sous la courbe (AUC) calculée allant de 0 à 1. Dans les tests médicaux, les rapports de vraisemblance (LR) négatifs sont utilisés pour comprendre l’utilité du test diagnostique ou pronostique. Essentiellement, le LR indique la probabilité qu'un patient souffre d'une affection ou d'une maladie. La probabilité qu’ils soient atteints de la maladie ou de l’affection augmente avec le rapport. En revanche, un ratio faible indique que ce n’est probablement pas le cas. Par conséquent, un médecin peut utiliser ces ratios pour admettre ou exclure une maladie. Le ratio, qui exprime la probabilité qu'une personne soit atteinte de la maladie ou de l'affection, soutient les SN et SP identifiés par la courbe ROC. Une autre définition du LR est SN et SP, où LR négatif = (100 - SN)/SP. Le coefficient de corrélation r de Spearman a été utilisé pour évaluer la corrélation entre diverses variables. De plus, les niveaux d'expression des protéines lncRNA CCDC144NL-AS1, hsamiR-143-3p et HMGA2 ont été définis selon la corrélation de Spearman r, et le lien entre deux variables - une continue et une dichotomique - a été évalué à l'aide d'une corrélation ponctuelle-bisériale. Le niveau de signification a été défini si la valeur p du test d'analyse statistique bilatérale est <0,05.