El efecto de la coenzima Q10 junto con medicamentos para la fertilidad en el resultado del embarazo de la fertilización in vitro (CoQ10-IVF)

El objetivo de este estudio es evaluar la eficacia de la administración de CoQ10 con respecto a su efecto sobre la tasa de aneuploidía de los ovocitos y la tasa acumulada de nacidos vivos.

Diseño del estudio Este es un estudio prospectivo, aleatorizado y controlado con placebo. Los participantes del estudio se someterán a hasta 3 ciclos como parte de este protocolo. Todas las evaluaciones clínicas se realizarán en las clínicas de infertilidad participantes.

El estudio se organizará de forma ambulatoria en el Centro de Toronto para Tecnología Reproductiva Avanzada (TCART). El estudio involucrará a 54 mujeres de 35 a 43 años que se someten a un tratamiento de FIV. Todas las mujeres recolectarán 2 ml de saliva en un tubo de polietileno de 5 ml para la medición inicial de la actividad de coQ10 mediante el ensayo arNOX (descrito a continuación).

Los participantes del estudio serán asignados al azar a placebo o cápsulas de COQ10 (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD códigos de registro 135307). Los participantes del estudio tomarán 600 mg de CoQ10 por vía oral una vez al día con el desayuno o cápsulas de placebo idénticas durante 2 meses antes de un ciclo de FIV y hasta 3 ciclos si no se produce el embarazo. En el día 3 del ciclo, los sujetos comenzarán la estimulación ovárica para la fertilización in vitro mientras continúan con el consumo de los suplementos. La estimulación ovárica controlada (COH, por sus siglas en inglés) consistirá en el protocolo de brotes de agonistas de GnRH en microdosis, que es el protocolo estándar de la clínica para mujeres mayores. La COH se realizará utilizando FSH recombinante (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Canadá) o gonadotropinas menopáusicas humanas (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Canadá) 150 unidades dos veces al día S.C. y Acetato de Buserelina (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg por vía subcutánea B.I.D, y continuará hasta el día anterior a 10.000 unidades de gonadotropina coriónica humana (hCG) (Pregnyl, Organon). La dosis no se cambiará y debe mantenerse durante la duración del estudio. Ambos medicamentos se continuarán diariamente hasta que el desarrollo folicular se considere adecuado (al menos 3 folículos >17 mm y el nivel de E2 sea aceptable para la cantidad de folículos presentes), momento en el cual se inyectará la hCG para desencadenar la maduración folicular final. La extracción de ovocitos se realizará 36 horas después mediante aspiración con aguja guiada por ultrasonido vaginal y con el uso de anestesia local y sedación suave. En el momento de la extracción, los sujetos recolectarán 2 ml de saliva, además, se recolectarán 2 ml de líquido folicular del primer folículo aspirado de cada ovario para determinar la actividad de coQ10 mediante el ensayo arNOX. COMO no es posible medir los niveles de CoQ10 en una sola celda (p. ovocitos), FF representa el entorno celular directo que puede reflejar el perfil metabólico de esta célula. Después de la recuperación, los ovocitos se fertilizarán con ICSI para no contaminar el ADN materno durante la muestra de biopsia de cuerpo polar con ADN de esperma. Al día siguiente, a todos los ovocitos con 2 pronúcleos se les realizará una biopsia de uno o ambos cuerpos polares.

Biopsia de cuerpo polar A continuación, el ovocito se insemina mediante la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y se mantiene en cultivo en una incubadora. Para realizar una biopsia del cuerpo polar, el ovocito se sujeta con la pipeta de sujeción con el cuerpo polar en la posición de las 11-12 en punto. Se hace una abertura en la zona pelúcida y se introduce una aguja de vidrio pulido en el espacio perivitelino y se extrae con cuidado el cuerpo polar.

La transferencia de embriones se realiza en la mañana del tercer día después de la extracción de óvulos.

Los cuerpos polares se lavan en gotitas de solución salina tamponada con HEPES isotónica y luego se transfieren a una solución hipotónica, se fijan en metanol: ácido acético en un portaobjetos de vidrio y se deshidratan en metanol para un análisis genético adicional. Todo el procedimiento no afecta negativamente ni a la fertilización ni a las tasas de escisión en los ovocitos biopsiados, ya que el cuerpo polar no está involucrado en los procesos anteriores. Cariotipo:

Los cuerpos polares se transferirán al centro de microarrays UHN para la determinación del número de cromosomas. El análisis se realizará con un kit comercial de Advalytix (Olympus Life Science Research, Munich, Alemania). Este es un kit basado en PCR multiplex que proporciona un recuento rápido y preciso de los 23 cromosomas y se adapta al recuento de cromosomas del cuerpo polar. Después de 2 días, se transferirá un solo embrión con un cariotipo normal a la cavidad uterina bajo guía ecográfica utilizando un catéter de transferencia de Cook (Cook, Sidney, Australia). El resto de embriones viables con cariotipo normal serán congelados (Congelación lenta). Luteal support consistirá en supositorios de progesterona de 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario, Canadá) por vía vaginal 3 veces al día a partir del día de la transferencia y continuará durante 2 semanas hasta el final de cada ciclo cuando se extraiga la beta hCG sérica y si está embarazada , se suspenderá CoQ10/placebo. Si está embarazada, el soporte lúteo continuará hasta las 10 semanas de gestación. Si la paciente no está embarazada se le realizará un ciclo de estimulación endometrial con estradiol micronizado, seguido de progesterona una vez medido el grosor endometrial suficiente. Cuatro días después, 1-2 embriones serán descongelados y transferidos. El soporte lúteo incluirá estradiol y progesterona que se mantendrán hasta 10 semanas si está embarazada. Estos ciclos de transferencia de embriones congelados se mantendrán mientras existan embriones congelados de la misma recuperación.

Los puntos finales del estudio serán:

1. La medida de resultado primaria será el número y porcentaje de huevos euploides por recuperación

2. Las medidas de resultado secundarias incluirán:

   • Respuesta ovárica
   • calidad embrionaria
   • Tasa acumulada de embarazo/recuperación
   • Tasa acumulada de nacidos vivos/recuperación
   • Actividad de CoQ10 en saliva y líquido folicular mediante ensayo arNOX

Ensayo de la coenzima Q10 arNOX es una proteína de la superficie celular de la NADH oxidasa externa relacionada con el envejecimiento (ECTO-NOX) inhibida por la coenzima Q10 que también está presente en el suero y la saliva. Es capaz de generar superóxido medido como reducción inhibida por superóxido dismutasa de ferricitocromo c (citocromo C oxidado). La coenzima Q10 inhibe la actividad de arNOX en la saliva de las personas mayores. La actividad aparece por primera vez después de los 30 años hasta un máximo cercano a los 55 años.

La actividad de arNOX se analiza a partir de mediciones de producción de superóxido basadas en el método estándar en el que la reducción de ferricitocromo c por superóxido se controla a partir del aumento de absorbancia a 550 nm con referencia a 540 nm. Como verificación adicional de la especificidad de la actividad de arNOX, se agrega superóxido dismutasa (SOD) cerca del final del ensayo para asegurarse de que la tasa regrese a la línea base. El ensayo consta de 150 μl (2 mg/ml) de solución de ferricitocromo c oxidado y 200 μl de saliva añadidos a 2,5 ml de tampón de ensayo (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2, 0,1 g de MgCl2, 1,35 g de glucosa disueltos en 1000 ml de agua desionizada, ajustado a pH 7,4, filtrado y almacenado a 4◦C). Las velocidades se determinan usando un espectrofotómetro en el modo de longitud de onda dual con mediciones continuas (más de 1 min cada 1,5 min). Después de 45 min, se añaden 60 μl (que contienen 60 unidades) de SOD y se continúa el ensayo durante 45 min más.

Se descubrió que el arNOX salival es un método conveniente y no invasivo para monitorear los niveles de arNOX en ensayos clínicos de intervención de coenzima Q10 con niveles de respuesta paralelos a los observados con el arNOX sérico y celular (Morre y Morre 2008).

Población de estudio

Un total de 54 pacientes femeninas que deseen quedar embarazadas se inscribirán en este estudio en TCART-Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology. Cada sujeto debe cumplir con los criterios de inclusión y exclusión del estudio.

Cálculo de potencia:

Un total de 54 pacientes participarán en este estudio de diseño paralelo de dos tratamientos. La probabilidad es del 90 % de que el estudio detecte una diferencia de tratamiento en dos colas con un valor de p ≤ 0,01, si la verdadera diferencia entre los tratamientos en la tasa de aneuploidía es del 25 %. Esto se basa en el supuesto de que la desviación estándar de la variable de respuesta es 0,180.

Asignación al tratamiento y aleatorización:

Los pacientes serán asignados en orden cronológico el día de la inscripción en el estudio a una aleatorización generada por computadora. Cada participante inscrito recibirá un paquete preasignado que contiene placebo o CoQ10 durante la duración del estudio. El médico estará cegado en cuanto a la asignación de los pacientes. La aleatorización se realizará antes de comenzar el primer ciclo.

Los investigadores mantendrán un registro separado que relacione los nombres de los sujetos con sus números de código, para permitir una fácil verificación de los datos en los archivos de los sujetos cuando sea necesario.

El análisis estadístico se realizará con la prueba t de Student para camper entre el grupo de tratamiento y el de placebo para todas las medidas de resultado. El análisis de potencia se calculó para alfa < 0,01.

Resultados anticipados y peligros potenciales. El número de pacientes necesarios para el estudio es razonable y no esperamos que sea un obstáculo. Si los resultados de este estudio son los del estudio en animales, deberíamos poder mostrar una diferencia significativa en el número de embriones euploides entre los grupos de prueba y de control, así como con los otros parámetros de resultado. Hemos estado trabajando durante varios meses con el laboratorio de microarrays de UHN para optimizar el uso del kit de PCR multiplex de Advalytics que actualmente funciona muy bien. No esperamos ningún problema con este componente del objeto.